王 淼,曹克鑫,陳志軍,張景航,甘紹印,常勇生,李文華,王忠民

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胸外科一病區(qū),河南 衛(wèi)輝 453100；2.河南省神經(jīng)修復重點實驗室,河南 衛(wèi)輝 453100；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科,河南 衛(wèi)輝 453100；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化科一病區(qū),河南 衛(wèi)輝 453100)

食管癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升，有半數(shù)以上的食管癌患者位于中國[1]。其中食管鱗狀細胞癌在食管癌中最為常見。食管鱗狀細胞癌是來源于食管黏膜上皮基底層的惡性腫瘤，病情進展快，僅以手術(shù)方式難以將其根治。隨著醫(yī)療科技水平的進步，免疫治療成為食管鱗狀細胞癌的治療方法之一。其中程序性死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)可作為免疫療法的代表，PD-1與程序性死亡蛋白配體-1(programmed cell death protein-ligand 1,PD-L1)結(jié)合可傳遞免疫反應的抑制信號，促使腫瘤細胞逃過免疫細胞的識別與殺傷，促進腫瘤的發(fā)展[2]。神經(jīng)叢素(plexins)家族已成為近些年來免疫治療的重要因子，被證實可在多種腫瘤組織中呈高表達[3]，plexins-A4蛋白屬于該家族。腦信號蛋白(Sema)是能夠完善免疫系統(tǒng)和促進神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一類信號素。plexins是Sema家族重要的特異性跨膜受體，二者結(jié)合后可促進腫瘤細胞的增殖分化、黏附及遷移等過程[3]。目前，國內(nèi)外關(guān)于plexins-A4、PD-1在食管鱗狀細胞癌中的表達相關(guān)報道較少。本研究旨在探討PD-1和 plexin-A4 在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及其對患者預后的影響，以期對食管鱗狀細胞癌的免疫治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2014年3月至2014年12月新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院收治的食管鱗狀細胞癌患者80例為研究對象，患者均經(jīng)組織病理學確診為食管鱗狀細胞癌并首次進行食管鱗狀細胞癌切除術(shù)，術(shù)前患者均無放射治療、化學治療史，且無其他部位腫瘤。80例患者中，男52例，女28例；年齡47～73(59.6±9.3)歲，其中>60歲者46例，≤60歲者34例；病理分型：髓質(zhì)型43例，潰瘍型27例，蕈傘型5例，縮窄型5例；吸煙44例，不吸煙36例；飲酒41例，不飲酒39例；組織分化程度：高分化38例，中分化32例，低分化10例；浸潤程度：T1期8例，T2期25例，T3期47例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。取所有患者術(shù)中切除的食管鱗狀細胞癌組織和距癌組織5 cm以上的正常食管鱗狀上皮組織(癌旁組織)，將一部分標本用甲醛固定后石蠟包埋保存，另一部分凍存于-80 ℃冰箱待用。

1.2 試劑與儀器plexin-A4抗體和PD-1抗體購自英國Abcam公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidline,DAB)顯色試劑盒、TRIzol試劑購自日本TaKaRa公司，兔抗人抗體試劑、焦炭酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、山羊血清購自北京中杉金橋生物科技公司，SYBR mix購自北京鼎國生物科技公司；紫外分光光度計、聚合酶鏈反應儀、光學顯微鏡購自美國ABI公司；plexin-A4、PD-1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測食管鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中plexin-A4和PD-1 mRNA 表達將低溫凍存的食管鱗狀細胞癌組織及癌旁組織分別在液氮預冷的研缽中研磨至粉末狀。加入1 mL TRIzol試劑，混勻后靜置5 min，12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液置入新的離心管中，加入0.5 mL異丙醇，在室溫下靜置10 min,12 000 r·min-1離心10 min，加入1 mL乙醇,7 500 r·min-1離心5 min，取沉淀棄上清液。將沉淀后的總RNA室溫干燥后溶解于20 μL DEPC水中，使用紫外分光光度計檢測RNA濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以GAPDH為內(nèi)參進行實時熒光定量聚合酶鏈反應。PD-1上游引物序列為5′-ATCTCACCGCTCGTTTCCT-3′，下游引物序列為5′-CACTGCAAACCTCGGTGATG-3′；plexin-A4上游引物序列為5′-TCTCAGTACAACGTGCTG-3′， 下游引物序列為5′-TAGCACTGGATCTGATTGC-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GTACGACTCACTATAGGGA-3′， 下游引物序列為5′-AACAGCGACACCCACTCCTCCA-3′。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)。反應體系20 μL：2×SYBR mix 10 μL，cDNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL，滅菌水6 μL 。采用2-△△Ct法計算目的基因plexin-A4和PD-1 mRNA相對表達量。

1.4 免疫組織化學法檢測食管鱗狀細胞癌組織中plexin-A4和PD-1蛋白表達取所有患者食管鱗狀細胞癌組織制備4 μm切片，經(jīng)脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復等處理后，加入山羊血清室溫封閉30 min，磷酸鹽緩沖溶液沖洗。加入一抗plexin-A4(滴度150)與PD-1(滴度150)，4 ℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖溶液浸洗切片并甩干，滴加二抗兔抗人抗體，室溫下孵育1 h。最后將組織切片用DAB和蘇木精染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。陽性細胞(即plexin-A4和PD-1蛋白表達細胞)判定標準：細胞被染成棕黃色。選取同一張切片上5個視野(200×)進行拍照，每個視野中計數(shù)100個食管鱗狀細胞癌細胞，并計數(shù)陽性細胞數(shù)，計數(shù)后取均值。陽性細胞數(shù)占100個癌細胞總數(shù)的比值≥50%為表達陽性。plexin-A4或PD-1蛋白陽性表達率=陽性表達例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5 隨訪通過查閱病歷、電話等對80例患者進行隨訪，記錄患者生存時間，隨訪截止日期為2019年6月。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中plexin-A4和PD-1 mRNA 相對表達量比較食管鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中plexin-A4 mRNA相對表達量分別為0.95±0.62、0.36±0.26，食管鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中PD-1 mRNA相對表達量分別為1.47±0.99、0.48±0.32。食管鱗狀細胞癌組織中plexin-A4和PD-1 mRNA相對表達量均顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 plexin-A4和PD-1在食管鱗狀細胞癌組織中的表達結(jié)果見圖1。plexin-A4主要表達于細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒；PD-1表達于細胞質(zhì)和細胞膜，呈棕黃色顆粒。plexin-A4和PD-1蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率分別為48.75%(39/80)和75.00%(60/80)。

A:plexin-A4蛋白表達；B：PD-1蛋白表達。

2.3 食管鱗狀細胞癌組織中plexin-A4、PD-1蛋白表達與臨床特征之間的關(guān)系結(jié)果見表2。plexin-A4蛋白表達與腫瘤的浸潤程度顯著相關(guān)(P<0.05)，與患者的性別、年齡、吸煙、飲酒、病理分型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。PD-1蛋白表達與患者的年齡、腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，與患者的性別、吸煙、飲酒、病理分型、分化程度無關(guān)(P>0.05)。

表1 PD-1和plexin-A4在食管鱗癌組織中表達的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of PD-1 and plexin-A4 expression in esophageal squamous cell carcinoma

2.4 食管鱗狀細胞癌組織中plexin-A4、PD-1蛋白表達水平與患者術(shù)后生存期的關(guān)系結(jié)果見圖2、3。plexin-A4陽性及plexin-A4陰性表達患者的5 a生存率分別為33.33%(20/60)和50.00%(30/60),PD-1陽性及PD-1陰性表達患者的5 a生存率分別為26.67%(16/60)和71.67%(43/60)。plexin-A4和PD-1陰性表達患者的5 a生存率顯著長于陽性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=1.461、11.673，P<0.05)。

圖2 食管鱗狀細胞癌組織中plexin-A4蛋白陽性表達與陰性表達患者生存曲線比較Fig.2 Survival curves of patients with positive and negative expression of plexin-A4 protein in esophageal squamous cell carcinoma tissues

圖3 食管鱗狀細胞癌組織中PD-1蛋白陽性表達與陰性表達患者生存曲線Fig.3 Survival curves of patients with positive and negative expression of PD-1 protein in esophageal squamous cell carcinoma tissues

2.5 食管鱗狀細胞癌患者單因素和多因素生存分析結(jié)果見表2和表3。分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-1表達水平為影響食管鱗狀細胞癌患者的獨立預后因素(P<0.05)。性別、年齡、病理分型、腫瘤浸潤程度、plexin-A4表達水平與食管鱗狀細胞癌患者生存期無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表2 食管鱗狀細胞癌患者臨床病理特征及plexin-A4、PD-1表達的Cox單因素生存分析Tab.2 Cox univariate survival analysis of clinicopathological characteristics and plexin-A4 and PD-1 expression of patients with esophageal squamous cell carcinoma

表3 食管鱗狀細胞癌患者臨床病理特征及plexin-A4、PD-1表達的Cox多因素生存分析Tab.3 Cox multivariate survival analysis of clinicopathological characteristics and plexin-A4 and PD-1 expression of patients with esophageal squamous cell carcinoma

3 討論

食管癌已成為消化道的常見惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，鱗狀細胞癌在食管癌的病理分型中達90%以上[4]。食管鱗狀細胞癌早期癥狀不典型，診斷較為困難，當患者出現(xiàn)吞咽困難等癥狀時多數(shù)已處于中晚期。目前，盡管治療食管鱗狀細胞癌有手術(shù)、化學治療及放射治療等多種方案，但臨床療效欠佳。隨著食管鱗狀細胞癌細胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，手術(shù)治療已難以延長患者的生命，術(shù)后5 a生存率僅為15%～25%[5]。目前，生物免疫療法已成為新興的治療手段，其中以PD-1/PD-L1靶點的免疫療法最為典型，該治療方法通過阻斷PD-1/PD-L1信號轉(zhuǎn)導通路，恢復機體正常免疫應答，并激發(fā)以T細胞為主的免疫細胞的生物學功能，抑制惡性腫瘤的免疫逃逸機制，進而殺傷腫瘤細胞。國內(nèi)外對PD-1/PD-L1通路的研究已獲得顯著性成果，PD-1被證實在鼻咽癌、黑色素瘤、肺癌等惡性腫瘤組織中的表達量較癌旁組織中均有明顯升高[6-8]。plexins家族是連接細胞膜內(nèi)外并產(chǎn)生生物學效應的類跨膜蛋白，其可作為信號素Semaphorins家族的重要受體，二者可結(jié)合形成復合體，參與腫瘤的增生、異型性突變與黏附等過程[9]。plexins受體包括plexin-A(1-4)、plexin-B(1-3)、plexin-C1、plexin-D1亞型[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細胞癌組織中plexin-A4和PD-1 mRNA相對表達量均顯著高于癌旁組織，提示plexin-A4和PD-1可促進食管鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展。

有研究表明，plexin-B1在胰腺癌組織中的陽性表達率為72.46%[11]，plexin-A1在人腦膠質(zhì)瘤組織中的陽性表達率為51.16%[12];PD-1在非小細胞肺癌的陽性表達率為61.67%[13]，PD-1在食管癌組織、癌旁非典型增生組織、正常食管組織陽性表達率依次為51.2%、22.9%和6.7%[14]。本研究結(jié)果顯示，plexin-A4和PD-1在食管鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率分別為48.75%(39/80)和75.00%(60/80)，提示PD-1較plexin-A4在腫瘤組織中可能有更高的陽性表達率。

本研究通過分析食管鱗狀細胞癌組織中plexin-A4、PD-1蛋白表達與臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，plexin-A4蛋白表達與腫瘤浸潤程度顯著相關(guān)，PD-1蛋白表達與年齡、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示plexin-A4和PD-1可能促進了食管鱗狀細胞癌的血管生成，PD-1可能促進淋巴管生成，從而使食管鱗狀細胞發(fā)生癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移；并且隨著食管鱗狀細胞癌患者年齡的增長及淋巴結(jié)擴散轉(zhuǎn)移，PD-1的表達有所增強；此外，PD-1在病理特征上較plexin-A4有更多的相關(guān)影響因素。本研究表明，plexin-A4在病理特征方面僅與腫瘤浸潤程度有顯著相關(guān)性，具有統(tǒng)計學意義的影響因素較少，可能原因是食管鱗狀細胞癌組織不夠新鮮，樣本量不足，腫瘤切片標本包含癌旁組織過多等，這些因素均會對研究結(jié)果造成偏差。

本研究結(jié)果顯示，plexin-A4和PD-1陰性表達患者的5 a生存率顯著長于陽性表達患者，提示plexin-A4和PD-1高水平表達會導致食管鱗狀細胞癌患者5 a生存率降低。此外，本研究結(jié)果顯示，分化程度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、PD-1表達水平為影響食管鱗狀細胞癌患者的獨立預后因素，提示低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-1高表達水平預示更長的生存期，且PD-1可作為標記食管鱗狀細胞癌患者預后的特異性標志物。

綜上所述，食管鱗狀細胞癌組織中plexin-A4和PD-1高表達可能促進食管鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展，且PD-1高表達可作為監(jiān)測腫瘤進展、臨床治療及預后評估的指標。但本研究樣本量較少、未采用免疫組織化學法檢測食管鱗狀細胞癌癌旁組織中plexin-A4和PD-1蛋白的表達情況、未進行食管鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中plexin-A4和PD-1蛋白陽性表達率的比較，有待進一步完善。目前，對于plexin-A4和PD-1在食管鱗狀細胞癌中的作用機制尚不明確，未來仍需進一步探討。