石曉欣，鄔亦華，昌 菁，王瑞良

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，上海 200092；2.上海國際醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌科，上海 200120)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是指發(fā)生急性心肌梗死后，在冠狀動脈缺氧缺血恢復(fù)灌注后組織損傷加重的病理過程。目前治療急性心肌梗死的再灌注方法(溶栓、介入治療等)均可能引起MIRI[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡是MIRI中的重要環(huán)節(jié)，在一定程度上反映心肌損傷的嚴(yán)重程度[2]。有研究表明，2型糖尿病伴MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著增高，異丙酚能夠有效緩解2型糖尿病大鼠MIRI，其機(jī)制與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)[3]。因此，抑制細(xì)胞凋亡成為防治MIRI的重要方法。微RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼單鏈小RNA，其在心肌梗死、心肌纖維化等病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，如miR-21可以縮小心肌梗死范圍[4]，miR-133可抑制心肌細(xì)胞凋亡[5]等。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-590在惡性腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]，上調(diào)miR-590-3p可抑制心肌細(xì)胞纖維化[7]，提示其與心血管疾病存在緊密聯(lián)系。但miR-590-3p在MIRI中的作用的研究報道較少。因此，本研究通過制備MIRI大鼠模型，觀察心肌組織中miR-590-3p表達(dá)、心肌細(xì)胞凋亡情況及血清炎癥因子、氧化應(yīng)激和心肌損傷標(biāo)志物的表達(dá)，探討過表達(dá)miR-590-3p對MIRI的作用及機(jī)制，旨在為臨床治療MIRI提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只購自河北伊維沃生物科技有限公司[許可證號：SCXK(冀)2019-008]，體質(zhì)量220～250 g，7～8周齡，飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi)，保持溫度(25±1)℃、濕度(50±5)%，12 h晝夜交替，自由飲食和活動。

1.2 試劑與儀器miR-590-3p、U6、agomir-miR-590-3p及agomir NC擴(kuò)增引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，RNA提取試劑、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測試劑盒、兔抗B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)單克隆抗體、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G二抗、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)、大鼠白細(xì)胞介素-1β(interkeulin-1β，IL-1β)檢測試劑盒、蛋白激酶K、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白定量試劑盒均購自北京百奧萊博科技有限公司，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)顯色液購自上海西唐生物科技有限公司，肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)酶聯(lián)免疫試劑盒均購自上海科順生物科技有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)儀購自美國Bio-Rad公司，全自動酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立將24只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、agomir-miR-590-3p組和陰性對照(negative control,NC)組，每組6只。4組大鼠術(shù)前24 h禁食，腹腔注射15 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉后取仰臥位固定，分離大鼠氣管，氣管插管后接呼吸機(jī)，呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)定為潮氣量10 mL，呼吸頻率70～80次·min-1，迅速開胸，于左側(cè)第3、4肋間沿胸骨左緣依次剪開胸骨、縱隔胸膜，露出心包，用鑷子夾起心包壁層并剪開，暴露心臟；agomir-miR-590-3p組大鼠于左心室前壁注入5 nmol agomir-miR-590-3p，NC組大鼠注入5 nmol agomir NC，假手術(shù)組和模型組大鼠注入等量生理鹽水；注射后，模型組、agomir-miR-590-3p組和NC組大鼠于左心耳與肺動脈圓錐間穿醫(yī)用縫合線結(jié)合硅膠管進(jìn)行套扎，拉緊絲線，形成心肌缺血，結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線，取出硅膠管使心臟恢復(fù)灌注2 h[8]；假手術(shù)組大鼠僅做開胸和心臟分離不進(jìn)行結(jié)扎。

1.3.2 大鼠血清中CK、LDH、MDA、SOD、IL-1β和TNF-α 水平測定4組大鼠模型建立后于腹主動脈采血，血液室溫自然凝固15 min，2 500 r·min-1離心20 min，收集上層血清，應(yīng)用全自動酶標(biāo)儀測定大鼠血清CK、LDH、TNF-α、SOD、MDA表達(dá)水平，嚴(yán)格按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 心肌組織取材及保存腹主動脈取血后斷頸法處死大鼠，開胸取出心臟，一半心肌組織使用40 g·L-1多聚甲醛固定后進(jìn)行常規(guī)組織切片，用于后續(xù)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色和TUNEL染色；另一半心肌組織置于液氮中保存，用于后續(xù)qRT-PCR檢測和Western-blot檢測。

1.3.4 qRT-PCR法檢測大鼠心肌組織中miR-590-3p表達(dá)分別取4組大鼠心肌組織100 mg，加入1 mL RNA提取試劑，冰上勻漿30 s后，加入0.2 mL氯仿，充分震蕩混合30 s后，室溫下15 000 r·min-1離心15 min，取上清液；在上清液中加入異丙醇，混合后，12 000 r·min-1離心10 min，獲取總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR法檢測miR-590-3p表達(dá)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，65 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸5 min，共30個循環(huán)。U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-590-3p上游引物序列為 5′-CCTTCCCATCTGTTCTCCCTTCC-3′， 下游引物引物序列為5′-CTGTATCTAGTTCCAAGCTGGGTGAT-3′。以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-590-3p相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.3.5 HE染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變?nèi)?0 g·L-1多聚甲醛溶液中浸泡固定的4組大鼠心肌組織，常規(guī)梯度乙醇脫水后二甲苯透明，石蠟包埋、切片(片厚約4 μm)，HE染色，中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3.6 TUNEL法檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況取4組大鼠心肌組織切片(片厚約4 μm)置于二甲苯中脫蠟10 min。換新鮮的二甲苯再脫蠟10 min，梯度乙醇水合。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗3次，每次5 min。滴加20 mg·L-1蛋白激酶K溶液，37 ℃反應(yīng)溫度下孵育20 min，PBS洗滌后，滴加50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次后，封片液封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，棕色為凋亡細(xì)胞。以凋亡細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例表示細(xì)胞凋亡率。

1.3.7 Western blot法檢測大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平分別取4組大鼠心臟組織100 mg，于勻漿器中盡量剪碎，加400 μL裂解液置于冰上勻漿；裂解30 min后，于4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min，取上清液。BCA法定量上清液總蛋白濃度，100 ℃煮10 min后置于-20 ℃冰箱保存；取蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜；加入50 g·L-1脫脂牛奶封閉2 h，PBS清洗PVDF膜，加入Bax、Bcl-2抗體稀釋液(稀釋度均為1500)，4 ℃過夜孵育；再次PBS清洗后滴加二抗稀釋液(稀釋度為15 000)，30 ℃孵育2 h；PBST清洗后，滴加ECL顯色液，應(yīng)用Image J凝膠成像儀分析各條帶灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogernase,GAPDH)為內(nèi)參，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠心肌組織中miR-590-3p相對表達(dá)量比較假手術(shù)組、模型組、NC組、agomir-miR-590-3p組大鼠心肌組織中miR-590-3p相對表達(dá)量分別為1.00±0.03、0.51±0.06、0.49±0.06、3.91±0.39。agomir-miR-590-3p組大鼠心肌組織中miR-590-3p相對表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組、模型組、NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組和NC組大鼠心肌組織中miR-590-3p相對表達(dá)量顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與NC組大鼠心肌組織中miR-590-3p相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 4組大鼠心肌組織病理學(xué)改變結(jié)果見圖1。假手術(shù)組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊；模型組和NC組大鼠心肌纖維斷裂，細(xì)胞排列較亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死；與模型組和NC組相比，agomir-miR-590-3p組大鼠心肌纖維斷裂和心肌細(xì)胞排列紊亂情況得到緩解。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：NC組；D：agomir-miR-590-3p組。

2.3 4組大鼠血清炎癥因子、氧化應(yīng)激及心肌損傷標(biāo)志物水平比較結(jié)果見表1。與假手術(shù)組比較，模型組、NC組和agomir-miR-590-3p組大鼠血清IL-1β、TNF-α、CK、LDH、MDA水平顯著升高，SOD水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和NC組比較，agomir-miR-590-3p組大鼠IL-1β、TNF-α、CK、LDH、MDA水平顯著下降，SOD水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與NC組大鼠血清IL-1β、TNF-α、CK、LDH、MDA、SOD水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 4組大鼠血清炎癥因子、氧化應(yīng)激及心肌損傷標(biāo)志物水平比較Tab.1 Comparison of serum inflammatory factors，oxidative stress markers and myocardial injury markers among the four groups

2.4 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較結(jié)果見圖2。假手術(shù)組、模型組、NC組、agomir-miR-590-3p組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率分別為(4.00±1.00)%、(46.67±7.64)%、(49.67±8.50)%、(27.67±7.51)%。模型組、NC組和agomir-miR-590-3p組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；agomir-miR-590-3p組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組和NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與NC組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：NC組；D：agomir-miR-590-3p組。

2.5 4組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較結(jié)果見表2和圖3。與假手術(shù)組比較，模型組、NC組和agomir-miR-590-3p組大鼠心肌組織中 Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和NC組比較，agomir-miR-590-3p組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與NC組大鼠心肌組織中 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1：假手術(shù)組；2：模型組；3：NC組；4：agomir-miR-590-3p組。

表2 4組大鼠心肌組織中Bcl-2和Bax相對表達(dá)量比較Tab.2 Comparison of relative expression of Bcl-2 and Bax in myocardial tissues of rats among the four groups

3 討論

急性心肌梗死是一種嚴(yán)重的缺血性心臟病，可導(dǎo)致心肌壞死、無法控制的心力衰竭甚至死亡。盡管再灌注治療對急性心肌梗死的治療有重要作用，但也不可避免地導(dǎo)致嚴(yán)重心律失常和心肌微血管功能障礙等不良反應(yīng)而限制了其臨床應(yīng)用[9]。研究表明，MIRI可能與再次供血供氧后的心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、中性粒細(xì)胞浸潤等有關(guān)[10]。目前關(guān)于MIRI的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。因此，深入研究MIRI發(fā)病的分子機(jī)制，對于開發(fā)有效的治療靶點(diǎn)、提高急性心肌梗死患者的生存率及生活質(zhì)量有重要意義。

miRNA是一類參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的非編碼單鏈RNA，在細(xì)胞增殖、分化、傳導(dǎo)、凋亡等方面發(fā)揮重要作用，與心血管疾病緊密相關(guān)[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a可通過抑制心肌細(xì)胞纖維化參與心臟的纖維化[13]。LESIZZA等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌缺氧缺血后立即給予合成的miR-590-3p脂質(zhì)制劑可顯著減少心肌梗塞面積并持續(xù)恢復(fù)心臟功能。YUAN等[15]研究表明，過表達(dá)miR-590-3p通過靶向鋅指E-BOX結(jié)合同源異型盒1抑制心臟成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和膠原合成，推測miR-590-3p可作為心肌梗死后恢復(fù)心臟功能潛在的治療靶標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，模型組和NC組大鼠心肌組織中miR-590-3p相對表達(dá)量顯著低于假手術(shù)組，agomir-miR-590-3p組大鼠心肌組織中miR-590-3p相對表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組、模型組、NC組，說明miR-590-3p在缺血再灌組心肌組織中呈低表達(dá)，在結(jié)扎前注入agomir-miR-590-3p導(dǎo)致大鼠缺血再灌注損傷心肌組織中miR-590-3p過表達(dá)。本研究HE染色檢測結(jié)果顯示，模型組和NC組大鼠心肌纖維斷裂，細(xì)胞排列較亂，部分心肌細(xì)胞死亡；agomir-miR-590-3p組大鼠心肌纖維斷裂和心肌細(xì)胞排列紊亂情況得到緩解。模型組、NC組和agomir-miR-590-3p組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物CK、LDH水平顯著高于假手術(shù)組；agomir-miR-590-3p組血清CK、LDH表達(dá)水平顯著低于模型組及NC組。該結(jié)果說明，缺血再灌注可導(dǎo)致心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞死亡，miR-590-3p過表達(dá)可通過抑制細(xì)胞死亡、維持正常心肌結(jié)構(gòu)對心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

MIRI顯著影響心肌缺血的治療效果，缺血后藥物預(yù)處理可通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)減輕再灌注損傷。何瑩瑩等[16]研究報道，鹿茸多肽通過激活核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化物反應(yīng)元件通路及降低血清心肌肌鈣蛋白等心肌酶水平對大鼠MIRI發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，模型組、NC組和agomir-miR-590-3p組大鼠血清IL-1β、TNF-α、MDA水平顯著高于假手術(shù)組，SOD水平顯著低于假手術(shù)組；agomir-miR-590-3p組大鼠血清IL-1β、TNF-α、MDA水平顯著低于模型組和NC組，SOD水平顯著高于模型組和NC組。這一結(jié)果表明，心肌缺血再灌注時可發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成心肌細(xì)胞損傷，過表達(dá)miR-590-3p可通過降低IL-1β、TNF-α、MDA水平及增加SOD水平抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)從而改善MIRI。

為進(jìn)一步研究miR-590-3p過表達(dá)對心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，本研究應(yīng)用TUNEL法檢測miR-590-3p過表達(dá)對MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，模型組、NC組和agomir-miR-590-3p組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于假手術(shù)組，agomir-miR-590-3p組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組及NC組，說明miR-590-3p過表達(dá)對心肌細(xì)胞凋亡有負(fù)調(diào)控作用。Bcl-2家族基因在細(xì)胞凋亡中起重要作用，Bcl-2作為原癌基因，通過編碼Bcl-2蛋白發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bax是Bcl-2家族中的一員，其發(fā)揮促凋亡作用[17]。Bax/Bcl-2是細(xì)胞凋亡的“開關(guān)”，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax水平較高時，Bax自身形成同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2水平較高時，Bax與Bcl-2形成異源二聚體而抑制凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組和NC組大鼠心肌細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下降；agomir-miR-590-3p組大鼠心肌細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組和NC組，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著高于模型組和NC組；這說明miR-590-3p可通過下調(diào)Bax蛋白、上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，從而改善MIRI。

綜上所述，miR-590-3p過表達(dá)能夠改善MIRI，該作用可能與其減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)、抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。