陳文換，楊峰燕，張艷華，白志超，高建芝

(1.涿州市醫(yī)院病理科，河北 涿州 072750；2.涿州市醫(yī)院腫瘤科，河北 涿州 072750；3.涿州市醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 涿州 072750)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer,PLC)是發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，其轉(zhuǎn)移率、復(fù)發(fā)率及致死率較高，近年來，PLC發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生命質(zhì)量[1-2]。研究顯示，微RNA(microRNA,miR)與PLC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，miR-543可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[3-4]。有研究顯示，腫瘤的生長和浸潤需要新生血管不斷提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，微血管密度(microvessel density,MVD)可反映腫瘤的血管生成程度，在腫瘤生物學(xué)行為演進(jìn)中起非常重要的作用[5-6]。本研究旨在探討PLC組織中miR-543表達(dá)與MVD的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年6月至2020年6月涿州市醫(yī)院收治的100例PLC患者作為觀察組，所有患者經(jīng)影像學(xué)及病理學(xué)檢查確診為PLC，術(shù)前未進(jìn)行放射治療、化學(xué)治療及動(dòng)脈栓塞治療，且無其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病及腫瘤。另選擇同期因外傷行部分肝切除的70例患者作為對照組，所有患者為外傷性肝破裂，并伴有失血性休克，且未合并肝癌及其他腫瘤。觀察組：男87例，女13例；年齡29～81(62.54±9.36)歲，體質(zhì)量指數(shù)25～42(29.26±4.23)kg·m-2；單發(fā)腫瘤56例，多發(fā)腫瘤44例；合并肝硬化64例，未合并肝硬化36例；腫瘤直徑<5 cm者59例，≥5 cm者41例；TNM臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期38例，Ⅲ、Ⅳ期62例。對照組：男49例，女21例；年齡23～76(60.49±8.27)歲，體質(zhì)量指數(shù)22～39(28.14±4.04)kg·m-2。2組患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，均有患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器TRIzol試劑盒購自天根生物科技(北京)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，CD34單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記兔鼠通用二抗試劑、抗原修復(fù)儀及LINK48自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀購于丹麥Dako公司。

1.3 qRT-PCR法檢測PLC組織和正常肝組織中miR-543的表達(dá)按照TRIzol試劑盒說明書裂解、提取PLC和正常肝組織中總RNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。miR-543上游引物序列為5′-GGGGAAACATTCGCGGTGCA-3′，下游引物序列為5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′。以U6為內(nèi)參，U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、5 min；變性95 ℃、25 s；退火60 ℃、50 s；延伸72 ℃、40 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。采取2-ΔΔCt法計(jì)算miR-543的相對表達(dá)量。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測PLC組織和正常肝組織中MVD石蠟組織連續(xù)切片(厚約4 μm)，65 ℃烤箱烤1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，抗原修復(fù)1.5 h，滴加阻斷劑、一抗CD34(滴度1100)、HRP二抗(滴度12 000)，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染、分化、藍(lán)化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以抗CD34單克隆抗體標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)MVD，按Weidner校正方法計(jì)數(shù)，先低倍鏡(40倍)下尋找癌組織中CD34陽性微血管最密集區(qū)域，再于高倍鏡(200倍)下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下微血管數(shù)量，取均值。

2 結(jié)果

2.1 PLC組織和正常肝組織中miR-543相對表達(dá)量比較PLC組織和正常肝組織中miR-543相對表達(dá)量分別為3.231±0.312、1.021±0.052，PLC組織中miR-543相對表達(dá)量顯著高于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.216，P<0.05)。

2.2 PLC組織和正常肝組織中MVD比較結(jié)果見圖1和圖2。CD34抗體表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒彌漫性分布。PLC組織和正常肝組織中MVD分別為44.79±8.54、9.68±3.27，PLC組織中MVD顯著高于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.175，P<0.05)。

圖1 PLC組織中CD34蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.1 Expression of CD34 protein in PLC tissues (immunohistochemical staining,×200)

圖2 正常肝組織中CD34蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.2 Expression of CD34 protein in normal liver tissues (immunohistochemical staining,×200)

2.3 miR-543表達(dá)和MVD與PLC病理特征的關(guān)系結(jié)果見表1。miR-543表達(dá)和MVD與腫瘤直徑、腫瘤分期有相關(guān)性(P<0.05)，而與腫瘤數(shù)目、是否合并肝硬化無相關(guān)性(P>0.05)。

表1 miR-543表達(dá)和MVD與PLC病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between miR-543 expression,MVD and pathological features of PLC

2.4 PLC組織中miR-543表達(dá)與MVD的相關(guān)性PLC組織中miR-543表達(dá)與MVD呈正相關(guān)(r=0.601，P<0.05)。

3 討論

PLC常見的組織學(xué)類型有肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌，大體上可分為孤立型、多結(jié)節(jié)型、彌漫型和巨塊型，多數(shù)晚期患者可見門靜脈癌栓形成。PLC的易感因素有乙肝病毒、乙醇及黃曲霉毒素等，在我國多由肝炎及肝硬化發(fā)展而來，目前臨床上多依賴病史、影像學(xué)及病理學(xué)檢查等進(jìn)行診斷[7-8]。PLC患者的預(yù)后較差，5 a存活率較低，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)給予治療可提高患者生存率。目前，肝癌最有效的治療方法為手術(shù)完整切除，無法手術(shù)或復(fù)發(fā)性腫瘤可采用肝動(dòng)脈栓塞等治療方法。肝癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多種向腫瘤細(xì)胞傳達(dá)增殖和細(xì)胞生存表型的遺傳學(xué)改變，包括染色體擴(kuò)增、雜合性缺失及突變等，可為臨床靶向治療提供依據(jù)。

miR屬于非編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核生物，參與基因表達(dá)調(diào)控及生物體發(fā)育時(shí)序等各個(gè)階段，且對惡性腫瘤具有雙向調(diào)節(jié)作用[9-10]。有文獻(xiàn)指出，miR-122、miR-26a等表達(dá)下調(diào)及miR-115、miR-221等表達(dá)上調(diào)與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[11]。研究顯示，miR-135a、miR-106b、miR-500a為肝細(xì)胞癌的致癌基因，miR-199a、miR-125、miR-26a為肝細(xì)胞癌的抑癌基因[12]；有研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌組織中miR-543表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，表明miR-543作為一種致癌基因參與細(xì)胞癌的生長和轉(zhuǎn)移[13]。本研究結(jié)果顯示，miR-543在PLC組織中的表達(dá)顯著高于正常肝組織，提示miR-543可能與PLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；同時(shí)，miR-543表達(dá)和MVD與腫瘤直徑、腫瘤分期有相關(guān)性，其在直徑≥5 cm及Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織中表達(dá)顯著升高，提示miR-543可能與腫瘤的增殖、侵襲有關(guān)。

肝臟為富血供器官，肝癌的肝內(nèi)、外轉(zhuǎn)移主要是通過血液，癌細(xì)胞可通過門靜脈系統(tǒng)在肝內(nèi)播散或轉(zhuǎn)移至肺，也可經(jīng)肝靜脈達(dá)下腔靜脈及右心房，少數(shù)可通過血行廣泛播散，發(fā)生腎上腺和骨轉(zhuǎn)移。血源性轉(zhuǎn)移多見于巨塊型和彌漫型肝細(xì)胞癌，發(fā)生轉(zhuǎn)移者臨床分期晚、預(yù)后差、生存率低，需選擇放射治療、化學(xué)治療、免疫治療等綜合性治療方案，因此，通過減少微血管形成而阻止腫瘤轉(zhuǎn)移成為醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)重要方向[14-15]。腫瘤的生長及侵襲等生物學(xué)行為依賴于間質(zhì)豐富的血供系統(tǒng)、新生血管形成及血液中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和分泌因子，癌組織中微血管形成情況可通過MVD得到反映[16-17]。有研究顯示，肝癌組織中MVD與組織分化程度、腫瘤大小、門靜脈癌栓及甲胎蛋白水平顯著相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，PLC組織中MVD顯著高于正常肝組織，PLC組織中MVD與腫瘤直徑、腫瘤分期有相關(guān)性，其在直徑≥5 cm及Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織中水平升高，且PLC組織中miR-543表達(dá)與MVD呈正相關(guān)，表明MVD高可能預(yù)示腫瘤生長速度快、轉(zhuǎn)移率高及預(yù)后不佳。

綜上所述，miR-543在PLC組織中表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)與腫瘤組織中MVD呈正相關(guān)，提示miR-543表達(dá)上調(diào)和腫瘤組織中MVD增加可能與PLC的進(jìn)展有關(guān)。本研究從基因?qū)用婧兔}管系統(tǒng)為闡明PLC的發(fā)病機(jī)制提供了必要的前期研究基礎(chǔ)，為PLC的早期診斷和靶向治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。