劉 敏 曾 靜 曾 云 吳麗芳

1.廣東省惠州市第二婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣東惠州 516008；2.廣東省惠州市第二婦幼保健院超聲科，廣東惠州 516008；3.廣東省惠州市第二婦幼保健院分子實驗室，廣東惠州 516008

頸項透明層（nuchal translucency，NT）是妊娠11～13+6周時超聲下顯示的胎兒頸后部皮下的液體生理性積聚，是胎兒非整倍體染色體畸形的敏感性指標[1]。目前臨床傳統(tǒng)的染色體核型分析技術僅能檢出非整倍體染色體數(shù)目及較大片段（＞10 Mb）的結構異常，在核型分析顯示正常的NT增厚胎兒中，仍有少部分胎兒出現(xiàn)各種結構畸形和遺傳綜合征等不良預后[2]。染色體微陣列技術（chromosome microarray analysis，CMA）相比傳統(tǒng)核型分析具有分辨率高，能檢出＞100 kb的拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNVs）的優(yōu)勢[3]。本研究旨在探討CMA檢測在NT增厚胎兒中的應用價值，為臨床遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年9月至2020年8月惠州市第二婦幼保健院妊娠早期行超聲篩查顯示NT≥2.5 mm胎兒203例，均行介入性產(chǎn)前診斷（絨毛/羊水取材術），獲取胎兒標本，同時行染色體核型分析及CMA檢測。納入標準：①孕11～13+6周；②單胎妊娠；③均進行遺傳咨詢并簽署知情同意書，排除夫妻雙方本身合并染色體異常疾病。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。依據(jù)文獻[4]對孕11～13+6周早孕期胎兒超聲篩查進行規(guī)范化操作及儲存圖像，測量胎兒NT值3次以上，記錄NT最大值，以NT≥2.5 mm定義為異常增厚，并按照不同胎兒NT厚度分為四組，2.5～2.9 mm組、3.0～3.9 mm組、4.0～4.9 mm組及≥5.0 mm組。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本采集 對NT增厚的胎兒在超聲儀（三星麥迪有限公司，型號：WS80A）引導下進行胎兒組織物取材術，并將胎兒組織標本，放置于4℃冰箱中保存待檢。

1.2.2 DNA提取 取得胎兒組織物標本后，經(jīng)規(guī)范處理，使用全基因組DNA提取試劑盒（廣州碩恒生物科技有限公司，品牌：Qiagen，生產(chǎn)批號：163011552）提取DNA，紫外分光度計（NanoDrop公司，型號：ND-1000）測定所提取DNA的濃度和純度。

1.2.3 染色體核型分析 取胎兒樣本，離心出干凈的絨毛標本，接種于培養(yǎng)基瓶中常規(guī)培養(yǎng)觀察，收獲標本進行常規(guī)制片，80℃烤6 h，采用G顯帶，顯微鏡下觀察30個中期分裂相，兩線鏡下各分析5個染色體核型，嵌合體以加倍計數(shù)分析。

1.2.4 CMA檢測 根據(jù)提供的基因芯片（Affymetrix公司，型號：CYTOSCAN 750k）標準實驗操作流程對所提取的全基因組DNA進行處理。具體操作流程是基因組DNA酶切消化、連接、聚合酶鏈式反應擴增、純化定量分析、片段化、標記，芯片雜交、洗滌、染色與掃描芯片。根據(jù)CMA檢測結果參考常用國際公共數(shù)據(jù)庫，如基因變異的數(shù)據(jù)庫（Database of Genomic Variants，DGV）及本實驗室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫，對CNVs的性質(zhì)進行判斷。

1.3 觀察指標及評價標準

觀察傳統(tǒng)染色體核型分析及CMA檢測NT增厚胎兒合并結構畸形類型及其檢出率的差異性，并比較不同NT值分組間采用CMA檢測致病性CNVs病例均數(shù)。檢測結果出現(xiàn)以下情況時均可判斷為致病性CNVs：該CNVs片段與DECIPHER數(shù)據(jù)庫中已知的微缺失/微重復綜合征區(qū)域相重疊；該片段遺傳自有相同表型的親代；臨床意義不明確的CNVs（variant s of uncertain significance，VOUS）：已知國際在線數(shù)據(jù)庫（如DGV，DECIPHER，ISCA等）中未找到重疊片段；片段內(nèi)含有功能尚不明確的基因。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 染色體核型分析及CMA檢測結果比較

傳統(tǒng)核型分析檢出染色體異常70例（34.98%），CMA檢測發(fā)現(xiàn)77例染色體異常，檢出率為37.93%，且額外檢出致病性CNVs共7例，見表1。

表1 染色體核型分析及CMA檢測結果比較（n=203）

2.2 不同NT值分組CMA檢測結果分析

2.5～2.9 mm組共檢出6例（16.22%）異常；3.0～3.9 mm組共檢出17例（22.67%）異常，其中2例致病性CNVs；4.0～4.9 mm組共檢出19例（40.43%）異常，其中2例致病性CNVs；≥5.0 mm組共檢出35例（79.55%）異常，其中1例致病性CNVs，2例為VOUS。另外，隨著NT值的增加，胎兒染色體異常發(fā)生率也隨之增加，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=47.322，P=0.000），見表 2。

表2 不同NT值分組CMA檢測結果分析

2.3 7例核型分析正常而CMA檢測異常結果分析

7例染色體核型正常的胎兒經(jīng)CMA檢測檢出的CNVs具有致病性，其中4例有微缺失綜合征，3例微重復綜合征，與傳統(tǒng)染色體核型分析檢測結果比較，CMA檢測的檢出率提高了3.45%（7/203），見表3。

表3 7例核型分析正常而CMA檢測異常結果分析

3 討論

染色體異常通常指染色體的數(shù)目及結構異常，是導致胎兒出生缺陷的主要原因，且其除了伴發(fā)多系統(tǒng)畸形外和智力障礙外，致殘率及致死率均高，給社會和家庭帶來了極大的精神和經(jīng)濟負擔[5-6]。隨著臨床技術的研究發(fā)展，CMA因其具有提高染色體檢出率顯著優(yōu)勢被廣泛應用于產(chǎn)前診斷中，CMA對NT增厚但染色體正常的胎兒進行CNVs判斷，所獲得具有臨床意義的染色體微缺失/微重復檢出率達7.7%～8.3%[7]。

本研究對孕早期NT增厚的胎兒進行傳統(tǒng)的染色體核型分析，染色體異常的檢出率為34.98%，主要包括染色體數(shù)目異常及少部分結構畸變等。但對NT增厚胎兒進一步行CMA檢測，額外檢出7例致病性染色體異常。在核型分析顯示染色體正常的胎兒中，可能隱藏著亞顯微結構的基因突變或基因CNVs，這往往與染色體微結構異?；蜻z傳綜合征相關[8]。而CMA針對產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結構異常的情況的檢測具有顯著診斷作用，其能夠檢測出傳統(tǒng)染色體核型分析無法檢測的CNVs和單親二倍體等[9]。關于NT值與胎兒CNVs的相關性，劉偉明[10]的研究顯示，隨著NT厚度的增加，CNVs發(fā)生率也隨之增高。在本研究中，不同NT值分組間CMA檢測染色體異常的發(fā)生率也明顯升高，因此認為NT增厚胎兒與胎兒染色體異常的發(fā)生率呈明顯的正相關。此外，本研究通過CMA額外檢出7例染色體微缺失/微重復，其片段大小介于 0.256 ～3.181 Mb，其中6例為致病性CNV，2例為VOUS。在不同NT值組中，CMA的檢出率高于傳統(tǒng)核型分析的3.45%，主要由于CMA可檢測傳統(tǒng)核型分析難以識別的亞顯微結構異常[11-12]。CMA作為最常用的臨床遺傳學診斷工具之一，在產(chǎn)前診斷的應用中，相比較于傳統(tǒng)的核型分析，其具有不可替代的重要性[13]。CMA的特點是在全基因組范圍內(nèi)高分辨檢測，尤其針對染色體的CNVs可進行精準檢測，可檢出傳統(tǒng)染色體核型分析所發(fā)現(xiàn)大部分異常及較小片段的微缺失/微重復，具有高分辨率、高通量、高自動化檢測的優(yōu)勢[14-15]。CMA技術在NT增厚的應用中，能夠檢出更多具有臨床意義的致病性疾病，在產(chǎn)前診斷標準檢測中具有可行性的重要意義。

綜上，胎兒NT增厚與染色體異常密切相關，CMA技術能檢測傳統(tǒng)核型分析無法識別的染色體微缺失/微重復，提高染色體疾病的檢出率，為產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢指導提供依據(jù)。