劉勇剛 黃俊勇 李 曦 羅美華

南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院 （佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院）腫瘤科，廣東佛山 528300

胃癌是全球病死率最高的腫瘤之一。由于早期癥狀隱匿，大部分患者確診時(shí)已屬于中晚期，5年生存率低于20%[1]。腫瘤的局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后差的主要因素之一[2]，但確切的分子機(jī)制尚未清楚。

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白家族（interferon-induced transmembrane proteins，IFITMs）共 有 4個(gè) 功 能性成員包括 IFITM1、IFITM2、IFITM3和 IFITM5，而IFITM4被證實(shí)是無功能的假基因[3]。目前，對(duì)于該家族的研究主要集中于抗病毒作用方面，其通過阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，IFITMs中的IFITM1、IFITM3均可通過介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的過程促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[6-7]。但針對(duì)IFITM2在胃癌中的研究鮮見報(bào)道。本研究探討IFITM2在胃癌組織中的表達(dá)情況及其對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例資料 收集2012年1月至2015年1月我院收治的54例胃癌患者癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本，其中男32例，女22例，平均年齡（50.67±7.35）歲，Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期43例。所有組織標(biāo)本取出后即刻冷凍于液氮中，保存在-80℃環(huán)境中。所有入選患者術(shù)前均未接受相關(guān)治療?；颊咝g(shù)后總生存期時(shí)間為手術(shù)后至胃癌相關(guān)疾病死亡時(shí)間，所有患者術(shù)后隨訪5年。本研究獲得南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并由每位患者簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞及試劑 免疫組織化學(xué)試劑盒購自西寶生物科技（上海）股份有限公司，GES-1及MKN45購自中國科學(xué)院上海生物工程研究中心，胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液、蘇木素購自美國Hycolon公司，6孔培養(yǎng)板購自上海廣銳生物科技有限公司，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自南京森貝伽生物科技有限公司，RNA提取試劑盒購自日本Takara公司，IFITM2、E-cadherin、Vimentin、GAPDH抗體購自美國CST公司，IFITM2沉默質(zhì)粒購自上海吉瑪基因公司。

1.2 方法

研究胃癌組織及細(xì)胞中IFITM2表達(dá)水平

1.2.1 免疫組化檢測蛋白表達(dá)水平 組織切片按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟操作，IFITM2一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS清洗3次后，室溫二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明后進(jìn)行封片、晾干分析。所有染色結(jié)果均由兩位病理科醫(yī)師單獨(dú)評(píng)估判定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，2～3 d進(jìn)行一次傳代。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞3 ml種植于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h后采用Lipofeetmnine 3000將200 pmol siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測基因表達(dá)水平 按照試劑盒說明書操作，分別提取胃癌組織、細(xì)胞中總RNA，采用SYBR Green法進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置為：在95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 蛋白印跡法（western blot）檢測蛋白表達(dá)水平 將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5% BSA室溫封閉1 h后加入一抗在4℃冰箱孵育過夜，室溫下二抗孵育1 h，采用ECL發(fā)光顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用Image J軟件計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 消化腫瘤細(xì)胞后平鋪于6孔板中，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行劃痕，加入含5%胎牛血清的RIPM 1640繼續(xù)培養(yǎng)。劃痕后0、48 h進(jìn)行顯微鏡下拍照。通過測量殘留劃痕寬度的方法來計(jì)算劃痕修復(fù)率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 侵襲實(shí)驗(yàn)（transwell）檢測細(xì)胞侵襲能力 將1.0×105個(gè)腫瘤細(xì)胞加入上室，同時(shí)加入200 μl不含胎牛血清的培養(yǎng)基，將400 μl含10%胎牛血清加入下室，放入培養(yǎng)箱中孵育48 h，進(jìn)行細(xì)胞固定、染色，并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFITM2在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平

與癌旁組織相比，胃癌組織中IFITM2的表達(dá)水平明顯升高，mRNA相對(duì)表達(dá)量分別（0.612±0.114）、（1.239±0.156）（t=-12.436，P=0.005），見圖1A。與GES-1細(xì)胞相比（mRNA表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為1后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)），MKN45中IFITM2 mRNA 的表達(dá)水平為（2.893±0.136）（t=-15.386，P=0.003），見圖 1B。

圖1 胃癌組織及細(xì)胞中IFITM2的表達(dá)水平

2.2 IFITM2的表達(dá)情況與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

分析54例胃癌組織中IFITM2 mRNA的表達(dá)水平，將高于中位值定為高表達(dá)組，而低于或等于中位值定為低表達(dá)組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFITM2的表達(dá)水平與TNM分期、浸潤程度、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜ 0.05），與性別、年齡和腫瘤分化程度無關(guān)（P＞0.05）。見表 1。

表1 IFITM2 mRNA的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系（n=54）

2.3 IFITM2與胃癌患者預(yù)后關(guān)系

通過Kaplan-Meier繪制生存曲線分析，低表達(dá)組5年總生存率為22%，高表達(dá)組為50%，結(jié)果表明高表達(dá)IFITM2與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)（χ2=8.166，P=0.0043），見圖 2。

圖2 胃癌患者IFITM2低、高表達(dá)組的生存曲線

2.4 沉默IFITM2表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞MKN45遷移及侵襲的影響

與對(duì)照組相比（mRNA表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為1后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)），siFIFTM2 mRNA（0.286±0.045）表達(dá)下調(diào)（t=-2.635，P=0.037），見圖 3A；與對(duì)照組（1.203±0.048）相比，siFIFTM2蛋白（0.302±0.051）表達(dá)水平下調(diào)（t=-2.755，P=0.024），見圖 3B。與對(duì)照組相比（遷移系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為1后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)），siRNA-IFITM2組 中 遷 移 系 數(shù)（0.263±0.089）下 降（t=-2.916，P=0.034），見 圖 3C；對(duì) 照 組 與siFIFTM2組侵襲的細(xì)胞數(shù)為（332.667±26.398）、（116.391±18.904）（t=-6.947，P=0.024），見圖 3D。

圖3 沉默IFITM2表達(dá)對(duì)MKN45遷移及侵襲的影響

2.5 沉默IFITM2后對(duì)MKN45細(xì)胞中 E-cadherin、Vimentin表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，siRNA-IFITM2組中E-cadherin mRAN（1.863±0.217）表達(dá)上調(diào)（t=-3.135，P=0.026），Vimentin的 相 對(duì) 表 達(dá) 水 平 為（0.289±0.0987）（t=3.644，P=0.018），見圖 4A。對(duì)照組與 siRNAIFITM2組E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.813±0.108）、（1.307±0.116）（t=-2.635，P=0.038）；對(duì)照組與siRNA-IFITM2組Vimentin蛋 白 相 對(duì) 表 達(dá) 量 分 別 為（0.736±0.114）、（0.326±0.098）（t=2.842，P=0.035），見圖 4B。

圖4 沉默IFITM2對(duì)MKN45中E-cadherin、Vimentin表達(dá)的影響

3 討論

胃癌是我國高發(fā)病率和高病死率的消化道惡性腫瘤之一，大部分胃癌患者就診時(shí)已處于局部晚期或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8]。近年來，雖然治療胃癌的方法不斷改善，但胃癌的病死率卻仍然較高[9]。影響患者生存預(yù)后的主要因素表現(xiàn)在通過血管和淋巴管導(dǎo)致的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10]，但其具體機(jī)制尚未完全明確。因此，尋找調(diào)控其侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，有望為臨床改善胃癌患者預(yù)后提供新的治療策略。

EMT過程涉及了E-cadherin、Vimentin等蛋白的參與，通過失去上皮樣細(xì)胞的特性及獲得間質(zhì)樣細(xì)胞的表型而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[11]。EMT改變了細(xì)胞原有的形態(tài)，并促使細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)，使細(xì)胞更具有侵襲性。另一方面，E-cadherin蛋白、Vimentin蛋白的異常表達(dá)又可以促使腫瘤細(xì)胞的EMT趨勢，降低細(xì)胞間相互聯(lián)系，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移[12]。研究發(fā)現(xiàn)IFITMs參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并往往扮演促癌基因的角色，如Ogony等[13]發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌中STAT2/BRG1復(fù)合體通過發(fā)生相互作用，激活I(lǐng)FITM1表達(dá)，促進(jìn)三陰性乳腺癌的侵襲表型；肺腺癌中，干擾IFITM3后腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力受到抑制[14]，Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)胰島素生長因子通過胰島素生長因子1受體/轉(zhuǎn)錄因子STAT3通路可以部分激活I(lǐng)FITM2表達(dá)；同時(shí)，激活的IFITM2又可以調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素6的表達(dá)及分泌促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。然而，目前針對(duì)IFITM2在胃癌中的研究極少報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，IFITM2在胃癌組織及細(xì)胞中明顯高表達(dá)（P＜0.01），其表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、浸潤程度、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)（P＜0.05）。通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的IFITM2與胃癌患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)（P＜0.01）。進(jìn)一步通過劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)分析siRNA-IFITM2組和對(duì)照組中細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)沉默IFITM2的胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)目顯著減少（P＜0.05），表明沉默IFTM2的表達(dá)能顯著抑制MKN45細(xì)胞的遷移和侵襲能力。并且發(fā)現(xiàn)沉默IFITM2后，E-cadherin的mRNA及蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），Vimentin的mRNA及蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），提示IFITM2通過調(diào)控E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)MKN45細(xì)胞的EMT進(jìn)程，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，IFITM2可能作為胃癌的促癌基因之一，有望成為其治療的潛在靶點(diǎn)，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究闡明。