雷芳，龔霞>

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院 兒科，重慶 402360)

哮喘是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、涉及多種細(xì)胞及細(xì)胞組分的慢性氣道異質(zhì)性炎癥性疾病。根據(jù)痰嗜酸粒細(xì)胞(EOS)和中性粒細(xì)胞(NEU)的比例，哮喘可分為4種炎癥亞型，其中中性粒細(xì)胞型哮喘(neutrophilic asthma，NA)在兒童群體中，尤其是嚴(yán)重哮喘表型中十分常見(jiàn)[1- 2]。氣道NEU與哮喘惡化、氣流受限及類(lèi)固醇抵抗有關(guān)，因此與EOS型哮喘相比，NA患兒肺功能下降更嚴(yán)重、急性發(fā)作次數(shù)更多，且哮喘標(biāo)準(zhǔn)治療對(duì)NA的治療效果差強(qiáng)人意[3]。近幾年，眾多研究集中在研究哮喘不同表型的病理生理學(xué)機(jī)制方面，試圖確定其潛在的治療靶標(biāo)。生物標(biāo)志物是一些生物狀態(tài)或微環(huán)境的定性或定量指標(biāo)，與疾病的發(fā)生、嚴(yán)重程度、病理生理學(xué)進(jìn)展以及治療反應(yīng)性或預(yù)后有關(guān)。血清顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性的多效性糖基化蛋白原。最近，Horinokita等[4]發(fā)現(xiàn)NEU彈性蛋白酶可以切割PGRN，進(jìn)而釋放顆粒蛋白；此外PGRN可抑制NEU脫顆粒和阻斷腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor α，TNF- α)信號(hào)的傳遞，而TNF- α信號(hào)通路激活被認(rèn)為是參與氣道NEU性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的重要分子機(jī)制[5]。然而，PGRN水平是否可作為一個(gè)新的反映哮喘嚴(yán)重程度的血清學(xué)指標(biāo)尚不清楚，故而本研究對(duì)血清PGRN水平與NA患兒氣道炎癥的關(guān)系，以及其對(duì)NA患兒急性發(fā)作的輔助診斷價(jià)值和臨床意義進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在這項(xiàng)觀察性隊(duì)列研究中，185例年齡在6～14歲之間的哮喘患兒被納入研究，處于哮喘急性發(fā)作期的患兒115例(急性組)，其中男67例，女48例，平均年齡(9.63±2.48)歲；處于臨床緩解期的患兒70例(緩解組)，其中男44例，女26例，平均年齡(9.30±2.87)歲。所有參與者均來(lái)自于2019年1月至10月期間在我院兒科就診的患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 年齡在6～14歲之間，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2) 急性組患兒首次發(fā)病，具有典型的臨床癥狀及體征(排除其他疾病因素)，且發(fā)病至血樣采集時(shí)間≤48 h；經(jīng)運(yùn)動(dòng)激發(fā)試驗(yàn)或支氣管激發(fā)試驗(yàn)陽(yáng)性，結(jié)合CT檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等明確哮喘診斷；(3) 臨床緩解期患兒哮喘癥狀體征消失，第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)，或者最大呼氣峰值流速(peak expiratory flow，PEF)≥80%預(yù)計(jì)值，且維持3個(gè)月及以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 近1個(gè)月內(nèi)接受激素或免疫抑制劑治療者；(2) 合并過(guò)敏性鼻炎、結(jié)核感染、肺炎、肺功能不全或其他器官?lài)?yán)重感染者。另外選取30例健康兒童作為對(duì)照組，其中男16例，女14例，年齡6～14歲，平均年齡(9.93±2.78)歲，體格檢查和肺功能檢查正常，排除任何感染性疾病、哮喘病史、過(guò)敏病史、免疫系統(tǒng)疾病等以及近1個(gè)月內(nèi)接受激素或免疫抑制劑治療者。急性組、緩解組和對(duì)照組年齡、性別構(gòu)成因素一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方案獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和法定監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 痰誘導(dǎo)檢測(cè) 急性組及緩解組患兒參照歐洲呼吸協(xié)會(huì)誘導(dǎo)痰液指導(dǎo)小組制訂的指南，痰液誘導(dǎo)前吸入400 μg沙丁胺醇10～15 min；生理鹽水漱口后用3%高滲鹽水超聲霧化吸入，囑患兒主動(dòng)咳痰。將3 ml痰液置于無(wú)菌試管中，加入4倍體積的0.1%二硫蘇糖醇(dithiothreitol)，在37 ℃水浴中孵育15 min，用離心機(jī)3 500 r·min-1離心10 min。沉淀物進(jìn)行涂片并對(duì)細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。鏡檢視野中鱗狀上皮細(xì)胞/有核細(xì)胞<20%痰涂片可用。根據(jù)痰液NEU是否≥61%以及EOS是否≥3%，將患兒分為NEU型(EOS<3%，NEU≥61%)、EOS型(EOS≥3%，NEU<61%)、混合型(EOS≥3%，NEU≥61%)和寡細(xì)胞型(EOS<3%，NEU<61%)。

1.2.2 肺功能檢查和病情嚴(yán)重程度分級(jí)[7]所有患兒在痰誘導(dǎo)前采用AS- 507肺功能檢查儀(日本美能公司)檢測(cè)用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、FEV1，計(jì)算FEV1占預(yù)計(jì)值的百分比(FEV1% pred)和FEV1/FVC，另外測(cè)定PEF。根據(jù)肺功能檢查，將患兒分為輕度、中度和重度組。

1.2.3 血清PGRN、炎癥因子測(cè)定 所有患兒分別采取外周靜脈血3、5 ml，將5 ml靜脈血3 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于-80 ℃儲(chǔ)存待測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme- linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定血清PGRN、TNF- α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 8水平，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；3 ml靜脈血采用SF- 3000型自動(dòng)全血分析儀(日本SYSmex公司)檢測(cè)全血NEU。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組患兒血清PGRN水平比較

急性組、緩解組、對(duì)照組患兒血清PGRN水平分別為(26.29±10.62)、(38.95±5.73)、(45.37±3.17)ng·ml-1，急性組和緩解組患兒血清PGRN水平低于對(duì)照組，尤其是急性組患兒血清PGRN水平降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=84.205，P<0.001)。

2.2 兩組哮喘患兒氣道炎癥分型以及血清PGRN水平比較

對(duì)于緩解組患兒，比較4個(gè)亞型血清PGRN水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.177，P=0.912)。但是對(duì)于急性組患兒，NEU型和混合型哮喘患兒血清PGRN水平低于EOS型和寡細(xì)胞型哮喘患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.148，P<0.001)，但是NEU型與混合型哮喘患兒血清PGRN水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.194，P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組哮喘患兒氣道炎癥亞型分布和血清PGRN水平比較

2.3 NA急性發(fā)作期患兒血清PGRN水平與肺功能的關(guān)系

NA急性發(fā)作期患兒隨著疾病嚴(yán)重程度的加重，各項(xiàng)肺功能指標(biāo)(FEV1%pred、FEV1/FVC、PEF)和血清PGRN水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。另外經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，NA急性發(fā)作期患兒血清PGRN水平與FEV1%pred、FEV1/FVC、PEF均呈正相關(guān)，r=0.756、0.703、0.411，P<0.001，見(jiàn)圖1。

圖1 NA患兒急性發(fā)作期時(shí)血清PGRN水平與肺功能指標(biāo)的關(guān)系

表2 NA急性發(fā)作期患兒不同疾病嚴(yán)重程度血清PGRN水平和肺功能指標(biāo)的差異

2.4 單因素和多因素分析影響NA急性發(fā)作期患兒疾病嚴(yán)重程度的危險(xiǎn)因素

經(jīng)單因素分析顯示，血清PGRN水平每升高1 ng·ml-1時(shí)NA急性發(fā)作期患兒進(jìn)展至重度的危險(xiǎn)率為0.877(95%CI：0.841～0.930，P<0.001)。進(jìn)一步校正年齡、性別、肥胖、痰液NEU和EOS百分比后，血清PGRN水平升高仍是NA急性發(fā)作期患兒重度疾病的獨(dú)立保護(hù)因素(OR=0.886，95%CI：0.847～0.958，P<0.001)。見(jiàn)表3。

表3 單因素和和多因素分析影響NA急性發(fā)作期患兒疾病嚴(yán)重程度的危險(xiǎn)因素

2.5 血清PGRN水平對(duì)重度NA急性發(fā)作期患兒的診斷價(jià)值

經(jīng)ROC曲線分析顯示，血清PGRN水平診斷NA急性發(fā)作期患兒重度疾病的AUC為0.876(95%CI：0.781～0.972)，cut- off值為19.51 ng·ml-1，在該閾值下靈敏度和特異度分別為73.90%和88.50%，約登指數(shù)為0.624，見(jiàn)圖2。

圖2 血清PGRN水平對(duì)NA急性發(fā)作期患兒重度疾病的診斷ROC曲線

2.6 NA急性發(fā)作期患兒血清PGRN水平與氣道炎癥的關(guān)系

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，NA急性發(fā)作期患兒血清PGRN水平與血清TNF- α水平、IL- 8水平、全血NEU計(jì)數(shù)均呈負(fù)相關(guān)，r=-0.537，-0.541，-0.413，P<0.001，見(jiàn)圖3。

圖3 血清PGRN水平與血清TNF- α水平、IL- 8水平、全血NEU計(jì)數(shù)的Pearson相關(guān)性

3 討 論

本研究中我們?cè)u(píng)估了血清PGRN水平在不同氣道炎癥亞型的哮喘患兒急性發(fā)作期、臨床緩解期表達(dá)水平的變化，對(duì)于以NEU氣道浸潤(rùn)為主的哮喘患兒，急性發(fā)作期時(shí)血清PGRN水平顯著低于臨床緩解期；而對(duì)于以EOS增多為主的哮喘患兒，血清PGRN在急性發(fā)作期和臨床緩解期的表達(dá)水平變化并不明顯。說(shuō)明血清PGRN水平降低與NEU增多之間存在一定的聯(lián)系，而且對(duì)于NA患兒在急性發(fā)作期時(shí)，隨著疾病嚴(yán)重程度的加重血清PGRN水平逐漸降低，并且與主要肺功能指標(biāo)(FEV1%pred、FEV1/FVC、PEF)呈正相關(guān)，說(shuō)明PGRN參與了NA的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程。另外TNF- α和IL- 8是調(diào)節(jié)氣道炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，血清PGRN水平與TNF- α水平、IL- 8水平、全血NEU計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明PGRN與NEU性氣道炎癥有關(guān)，這可能是誘發(fā)嚴(yán)重NA的重要原因。

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病，這種異質(zhì)性反映在病理學(xué)、臨床進(jìn)展過(guò)程和對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療反應(yīng)性的差異。了解造成異質(zhì)性的分子機(jī)制可為患者的個(gè)體化治療提供一定的理論基礎(chǔ)，例如，抗白細(xì)胞介素- 5和抗IgE分別用于治療EOS炎癥和2型輔助性T細(xì)胞(type 2 T- helper cell)升高為主的重癥哮喘患者。但是目前針對(duì)NEU氣道炎癥優(yōu)勢(shì)浸潤(rùn)的哮喘尚無(wú)有效的治療策略，這與對(duì)這些患者哮喘發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)不足有關(guān)。雖然NEU表型可見(jiàn)于大多數(shù)哮喘患兒，但從比例上分析，在嚴(yán)重哮喘表型中更為常見(jiàn)，這可能是因?yàn)镹EU性氣道炎癥與氣道微生物菌群組成、哮喘惡化、空氣受限和類(lèi)固醇抵抗等因素有關(guān)[8- 9]。Grunwell等[10]認(rèn)為NA患兒氣道NEU機(jī)能障礙，使促炎癥介質(zhì)和顆粒釋放更多，導(dǎo)致平滑肌收縮、黏膜水腫、呼吸道上皮結(jié)構(gòu)損壞及呼吸道重構(gòu)，引發(fā)支氣管狹窄、肺功能下降。除此以外，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)血清PGRN水平降低也是NA患兒急性發(fā)作期肺功能降低和氣道炎癥反應(yīng)加重的重要原因之一。

PGRN是一種分泌型、多功能糖蛋白，在支氣管上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)，屬于一類(lèi)強(qiáng)有力的抗炎分子，其抗炎作用是通過(guò)抑制NEU脫顆粒進(jìn)而激活TNF- α相關(guān)炎癥信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的[11]。PGRN可被多種基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)、NEU彈性蛋白酶等降解，形成顆粒蛋白發(fā)揮促炎作用，并中和PGRN的抗炎作用[12]。例如，顆粒蛋白B可刺激氣道上皮細(xì)胞中IL- 8的表達(dá)，誘導(dǎo)NEU吞噬和殺菌性能增加[13]。目前為止，已知有20多種蛋白可與PGRN結(jié)合，尤其是富含半胱氨酸的腫瘤壞死因子受體1/2(tumor necrosis factor receptor，TNFR1/2)，Tang等[14- 15]證實(shí)，PGRN與TNFR1和TNFR2的結(jié)合能力基本一致，但是都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TNF- α。哮喘的特征之一是支氣管高反應(yīng)性，即由各種特異性和非特異性刺激引起的過(guò)度支氣管痙攣。這種反應(yīng)在健康人群中是不會(huì)發(fā)生的，但是這種現(xiàn)象的病理機(jī)制尚不完全清楚。眾所周知，不同的哮喘表型其氣道反應(yīng)性也有所差異，這強(qiáng)調(diào)了氣道上皮細(xì)胞的重要性。上皮細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子以及支氣管收縮/擴(kuò)張因子，如IL- 6、IL- 8、TNF- α等通過(guò)直接改變氣道平滑肌的特性而參與氣道高反應(yīng)性的發(fā)生。對(duì)于嚴(yán)重的EOS型哮喘，2型免疫細(xì)胞因子(如IL- 4、IL- 5和IL- 13)的過(guò)度產(chǎn)生被認(rèn)為是關(guān)鍵的病理機(jī)制。阻斷這些分子或其受體的生物制劑的開(kāi)發(fā)，以及證實(shí)其有效性和安全性的臨床試驗(yàn)正在不斷進(jìn)行。因此，PGRN/TNF- α信號(hào)通路有望成為一種新的抑制NEU型氣道高反應(yīng)性的潛在機(jī)制。

為了支持上述推斷，在本研究中我們通過(guò)單因素和多因素Logistic回歸分析證實(shí)，血清PGRN水平降低是NA急性發(fā)作期患兒哮喘加重的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且低水平的血清PGRN可作為重度NA的診斷指標(biāo)，而且作為NEU相關(guān)抗炎因子，血清PGRN水平降低也反映了NEU性氣道炎癥狀態(tài)。例如，Chen等[16]使用人痰標(biāo)本評(píng)估了PGRN可能對(duì)慢性阻塞性肺疾病的影響，發(fā)現(xiàn)痰PGRN水平與NEU彈性蛋白酶和蛋白酶3等NEU炎癥標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)，而且血清PGRN水平降低可作為慢性阻塞性肺疾病急性加重的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。雖然PGRN在NEU氣道炎癥發(fā)生發(fā)展中的確切作用機(jī)制尚不清楚，但我們的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了血清PGRN水平降低與氣流受限引起的重度NA有關(guān)，同時(shí)血清TNF- α、IL- 8水平降低且全血NEU計(jì)數(shù)增高。而且我們校正一些重度哮喘的高危因素后，血清PGRN仍然是NA急性發(fā)作期患兒哮喘加重的獨(dú)立影響因素。嚴(yán)重哮喘對(duì)于哮喘的治愈是個(gè)非常重要的障礙，其肺功能降低、氣流受限程度加重以及小氣道重構(gòu)等都增加了臨床治療的困難。在本研究中我們只是初步鑒定了PGRN可能是重度NEU型急性發(fā)作期哮喘的生物學(xué)標(biāo)志物之一，未來(lái)還需要加深對(duì)PGRN分子機(jī)制的研究，并結(jié)合已知的細(xì)胞因子和趨化因子等進(jìn)一步確認(rèn)PGRN在NEU性氣道炎癥調(diào)節(jié)中的作用。

綜上所述，NA患兒急性發(fā)作期血清PGRN水平較臨床緩解期有所降低，而且與嚴(yán)重哮喘和NEU型氣道炎癥有關(guān)。因此檢測(cè)血清PGRN水平可以反映NA患兒急性發(fā)作期的疾病嚴(yán)重程度，其有望成為一種新的抑制NEU型氣道高反應(yīng)性的潛在靶點(diǎn)。