丁寧，王敬君，劉歡，李翠紅>

(鐵嶺市中心醫(yī)院 血液風(fēng)濕免疫科，遼寧 鐵嶺 112000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性炎癥和成纖維樣滑膜細(xì)胞增生(fibroblast- like synoviocytes，F(xiàn)LSs)為特征的免疫性疾病[1]，F(xiàn)LSs屬于侵襲性表型，產(chǎn)生過多的促炎細(xì)胞因子和基質(zhì)降解酶，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙和破壞[2]。因此，鑒定特異性靶向FLSs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子可能為 RA提供新的治療靶點(diǎn)。CD109是一種細(xì)胞表面抗原，作為一種糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白，CD109在各種腫瘤中的表達(dá)增加表明了更具侵襲性的表型和不良的預(yù)后[3]。由于FLSs表現(xiàn)出腫瘤樣增殖和侵襲行為，CD109可能在其中發(fā)揮作用。據(jù)報(bào)道，CD109與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose- regulated protein 78，GRP78)相互作用，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor- beta，TGF- β)信號(hào)傳導(dǎo)以應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4]，而GRP78是導(dǎo)致RA加重的重要病理因素[5]，推斷CD109可能參與RA的病理進(jìn)展。然而該推斷尚缺乏臨床證據(jù)支持。本研究旨在探討CD109在RA患者滑膜組織中的表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度及關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)的關(guān)系，為尋找新的治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究采集了56例符合《2018年中國(guó)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診療指南》[6]及2010年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)和歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]的RA患者(研究組)的滑膜組織，所有患者均于2019年2月至2020年1月在我院進(jìn)行滑膜切除術(shù)或關(guān)節(jié)置換手術(shù)。研究組中男21例，女35例；平均年齡(56.13±7.37)歲；病程26～130個(gè)月，平均(57.09±21.06)個(gè)月。28個(gè)關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)和CRP濃度(disease activity score in 28 joints with C- reactive protein，DAS28- CRP)評(píng)分≥2.6分，臨床資料完整，手術(shù)前所有患者均使用改善疾病的慢作用抗風(fēng)濕藥物，包括甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、羥氯喹、來氟米特，而沒有使用生物制劑。另外選取30例接受全關(guān)節(jié)置換術(shù)的膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)患者作為對(duì)照組，其中男15例，女15例；平均年齡(54.83±6.45)歲。所有患者排除其他免疫系統(tǒng)疾病、全身感染性疾病、惡性腫瘤、其他基礎(chǔ)性疾病者。兩組患者年齡、性別構(gòu)成等一般因素一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究得到我院機(jī)構(gòu)評(píng)審委員會(huì)的批準(zhǔn)，并根據(jù)赫爾辛基宣言的建議進(jìn)行推進(jìn)?；颊咴诓杉瘶颖厩岸己炇鹆藚⑴c研究的知情同意書。

1.2 臨床和實(shí)驗(yàn)室評(píng)估

56例RA患者在基線時(shí)接受臨床評(píng)估，包括腫脹關(guān)節(jié)的數(shù)量(評(píng)估28個(gè)關(guān)節(jié))和受累關(guān)節(jié)的數(shù)量(評(píng)估28個(gè)關(guān)節(jié))。采用DAS28- CRP評(píng)分低活動(dòng)度(2.6～3.2分)、中活動(dòng)度(>3.2～5.1分)、高活動(dòng)度(>5.1分)對(duì)患者進(jìn)行亞組分析。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括患者全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體水平、C反應(yīng)蛋白(CRP)和紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)水平。

1.3 關(guān)節(jié)滑液炎癥因子檢測(cè)

手術(shù)前3 d采集RA患者關(guān)節(jié)滑液(synovial fluid，SF)樣本1 ml，取樣后即刻用1 μg·ml-1透明質(zhì)酸酶處理，1 000 r·min-1離心5 min。上清液3 000 r·min-1離心10 min去除不溶性物質(zhì)。樣本保存在-80 ℃，6個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)。將含有可見血液的SF樣本排除，用微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)(Cytometric Bead Array，CBA)檢測(cè)SF樣本中的細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 6、IL- 8、IL- 10、IL- 1β、IL- 17A、基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP- 3)、腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor- alpha，TNF- α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)- β1。

1.4 組織CD109測(cè)定

取RA和KOA手術(shù)患者的滑膜組織，石蠟包埋，用10% 乙二胺四乙酸脫鈣，采用親和純化的單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)檢測(cè)滑膜組織CD109表達(dá)。先用0.3% 的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min，將組織切片與稀釋的正常山羊血清孵育，然后與親和純化的鼠抗人CD109多克隆抗體(1∶25稀釋)孵育過夜(8～10 h)，以同型配對(duì)抗體作為對(duì)照，以堿性磷酸酶標(biāo)記的親和純化的抗鼠IgG作為第2抗體孵育30 min，清洗后用APAAP復(fù)合物共同孵育30 min，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，結(jié)果呈棕色，最后切片用蘇木精進(jìn)行反染色。由兩名獨(dú)立的觀察者計(jì)算不同細(xì)胞群的陽性細(xì)胞數(shù)量[細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)棕色染色]和總細(xì)胞數(shù)(藍(lán)色染色)，每個(gè)標(biāo)本至少隨機(jī)選取5個(gè)視野。采用二級(jí)積分法進(jìn)行半定量分析,以陽性染色百分比×染色強(qiáng)度作為總積分指數(shù):-(<1分)、+(1～3分)、++(4～6分)、+++(7～12分)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者組織CD109陽性表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，研究組的組織CD109陽性表達(dá)率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。兩組患者組織CD109陽性表達(dá)情況見圖1。

表1 兩組的組織CD109表達(dá)情況

A.研究組；B.對(duì)照組

2.2 RA患者組織CD109陽性表達(dá)與疾病活動(dòng)度的關(guān)系

低活動(dòng)度組、中活動(dòng)度組和高活動(dòng)度組3個(gè)亞組比較，患者RA病程、RF+、CCP+、CRP、ESR、組織CD109表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低活動(dòng)度組相比，中活動(dòng)度組和高活動(dòng)度組病程、CCP+、CRP、ESR以及組織CD109表達(dá)均升高(P<0.05)，同時(shí)中活動(dòng)度組RF+高于低活動(dòng)組；與中活動(dòng)組相比，高活動(dòng)度組病程、CRP、ESR、組織CD109表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 比較不同DAS28- CRP評(píng)分RA患者基本臨床資料

2.3 多元線性回歸分析組織CD109表達(dá)與疾病活動(dòng)度的關(guān)系

以DAS28- CRP作為因變量，納入性別、年齡、病程、RF、CCP、CRP、ESR以及組織CD109作為自變量，經(jīng)多元線性回歸分析，CRP、組織CD109表達(dá)是影響RA患者疾病活動(dòng)度的獨(dú)立臨床因素(P<0.05)，見表3。

表3 多元線性回歸分析與RA患者疾病活動(dòng)度相關(guān)的臨床因素

2.4 RA患者組織CD109陽性表達(dá)與關(guān)節(jié)局部炎癥因子的關(guān)系

與CD109-組比較，CD109++組和CD109+++組IL- 6、IL- 8、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α水平顯著上升(P<0.05)，同時(shí)CD109+++組TGF- β1顯著下降(P<0.05)，見表4。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)性檢驗(yàn)，RA患者組織CD109表達(dá)與IL- 6、IL- 8、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α水平呈正相關(guān)性(P<0.05)，與TGF- β1水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05) ,見表5。

表4 比較組織CD109不同表達(dá)情況的RA患者關(guān)節(jié)滑液中IL- 6、IL- 8、IL- 10、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α、TGF- β1水平差異

表5 RA患者組織CD109與IL- 6、IL- 8、IL- 10、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α、TGF- β1的相關(guān)性

3 討 論

抑制炎癥反應(yīng)是治療 RA的研究重點(diǎn)。本項(xiàng)研究中我們發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織CD109陽性表達(dá)與疾病活動(dòng)度較高以及關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)加重有關(guān)。CD109是一種細(xì)胞表面抗原，屬于α2- 巨球蛋白/C3、C4、C5家族的硫酯類蛋白[8]。CD109作為一種糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞表面，尤其是在各種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，這與腫瘤細(xì)胞更具侵襲性表型和預(yù)后不良有關(guān)。例如車瀟良等[9]學(xué)者證實(shí)CD109在人宮頸鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，且在非角化型鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)水平高于角化型，推測(cè)其在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、增殖、分化中起重要作用。Liu等[10]通過檢測(cè)銀屑病組織樣本中CD109、SMAD7、TGF- β1等因子的表達(dá)，證實(shí)CD109屬于一種新的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子輔助受體，通過增強(qiáng)SMAD7依賴的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Ⅰ型受體(TGF- β type Ⅰ receptor)表達(dá)來抑制TGF- β1信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而在銀屑病中表達(dá)異常。此外Song等[11]通過分裂RA患者滑膜組織中的FLSs細(xì)胞證實(shí)，抑制組織CD109表達(dá)后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL- 6、IL- 8、IL- 1β以及MMP- 3水平明顯降低，而且敲除CD109基因后可明顯降低TNF- α或IL- 1β誘導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸激酶、核轉(zhuǎn)錄因子- kappa b、 STAT3和 p38 MAPK信號(hào)蛋白的磷酸化水平?？傊?，上述數(shù)據(jù)均表明抑制CD109在限制 FLSs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中具有十分重要的作用。本研究中我們通過檢測(cè)關(guān)節(jié)滑液中IL- 6、IL- 8、IL- 10、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α、TGF- β1水平也發(fā)現(xiàn)，組織CD109表達(dá)與IL- 6、IL- 8、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α呈正相關(guān)性，與TGF- β1呈負(fù)相關(guān)， IL- 6、IL- 8、IL- 1β、IL- 17A、MMP- 3、TNF- α、TGF- β1都參與了RA FLSs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，因此這也說明CD109可能是介導(dǎo)FLSs分泌促炎因子的重要介質(zhì)。然而之前也有研究發(fā)現(xiàn)，雖然CD109能夠抑制TGF- β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和隨后的纖維化進(jìn)程，但是CD109蛋白水平升高的成纖維細(xì)胞仍然能夠產(chǎn)生細(xì)胞外間質(zhì)分子。因此，可能抑制CD109表達(dá)并不足以完全抵消TGF- β1激活對(duì)纖維化的影響，關(guān)于具體的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

RA是一種常見的全身性、異質(zhì)性和自身免疫性疾病，以慢性、浸潤(rùn)性和對(duì)稱性小關(guān)節(jié)炎為主要臨床特征，可影響肺、腎臟和心臟等多個(gè)器官。目前，該病的發(fā)病機(jī)制尚未明確。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，這是由于免疫系統(tǒng)紊亂，如由多種外源性感染因素或遺傳易感性等導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞失衡、 T淋巴細(xì)胞亞群異常激活等所致[12]。作為近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型CD4+T細(xì)胞亞群，濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cells，Tfh)的主要功能是協(xié)助維持淋巴細(xì)胞平衡和誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答。Tfh可分泌大量免疫炎癥因子，如IL- 6、IL- 17A等[13]，這兩個(gè)因子與TGF- β1相互作用，活化大量參與機(jī)體免疫反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞。IL- 6、IL- 17A是人體免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素，能促進(jìn)細(xì)胞分化、刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，從而參與人體的應(yīng)激反應(yīng)[14]。TGF- β1則是一種重要的促成骨細(xì)胞因子，能抑制破骨細(xì)胞的形成，促進(jìn)成骨細(xì)胞的發(fā)育，促進(jìn)骨形成[15]。MMP- 3是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，它不僅降解骨質(zhì)和軟骨，損傷RA患者的關(guān)節(jié)，而且還誘導(dǎo)其他基質(zhì)金屬蛋白酶發(fā)揮生物學(xué)作用，破壞人體的關(guān)節(jié)[16]。本研究中滑膜組織CD109表達(dá)與滑液樣本中TGF- β1、MMP- 3水平有關(guān)，而且經(jīng)多元線性回歸分析顯示，滑膜組織CD109表達(dá)與RA患者疾病活動(dòng)度呈獨(dú)立正相關(guān)，這也說明CD109是參與RA疾病進(jìn)展的重要分子，并且有望成為RA 治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，滑膜組織CD109表達(dá)量升高與RA疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，并且對(duì)關(guān)節(jié)局部炎癥因子如IL- 6、IL- 8、TNF- α等的分泌有一定的促進(jìn)作用，提示CD109可能是RA治療的候選因子。