鄒陳蔚，張季，吳淼淼 ，高昳，陳海姣，劉鵬飛，沈衛(wèi)東>

(1．南通大學(xué)附屬江陰醫(yī)院 消化內(nèi)科，江蘇 江陰 214400； 2.徐州醫(yī)科大學(xué)江陰臨床學(xué)院 消化內(nèi)科，江蘇 江陰 214400；3.南通大學(xué)附屬江陰醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 江陰 214400)

食管癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一[1]。一般認(rèn)為，食管癌是由上皮內(nèi)瘤變逐步發(fā)展而來(lái)，但目前臨床上僅有少數(shù)患者可以通過(guò)體檢發(fā)現(xiàn)早期食管癌或食管上皮內(nèi)瘤變，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)食管癌時(shí)已處于食管癌晚期。晚期食管癌的治療效果差，5年生存率相對(duì)早期食管癌明顯偏低。因此，發(fā)現(xiàn)一種新的分子標(biāo)志物對(duì)于食管癌的早期診斷和預(yù)防具有重要意義。

空泡型質(zhì)子泵(V- type proton ATPase，V- ATPase)是廣泛存在于真核細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜的多亞基復(fù)合物，由水解ATP的外圍結(jié)構(gòu)域(V1)和質(zhì)子通道膜內(nèi)區(qū)域(V0)組成，擁有調(diào)節(jié)細(xì)胞酸堿平衡的功能[2]。多項(xiàng)研究表明，V- ATPase在惡性腫瘤組織中的表達(dá)升高，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、耐藥均可產(chǎn)生影響[3- 5]。ATP6V1A作為質(zhì)子泵上V1結(jié)構(gòu)域內(nèi)的亞基，則在V- ATPase的正常運(yùn)轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要作用。本研究探討了ATP6V1A在食管癌發(fā)生及進(jìn)展中的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集南通大學(xué)附屬江陰醫(yī)院2012至2019年經(jīng)手術(shù)、胃鏡活檢所取得的病理診斷為慢性炎、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、鱗狀細(xì)胞癌的食管病理組織共160例，并收集對(duì)應(yīng)患者相關(guān)臨床資料。以病理診斷為食管慢性炎的組織作為對(duì)照(慢性炎組)，其余標(biāo)本按各自病理診斷進(jìn)行分組并作為實(shí)驗(yàn)組。慢性炎組患者共20例，其中男13例，女7例，平均年齡(59.45±14.36)歲。低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組患者共16例，其中男7例，女9例，平均年齡(65.31±6.56)歲。高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組患者共21例，其中男15例，女6例，平均年齡(68.86±5.74)歲。食管癌組患者103例，其中男61例，女42例，平均年齡(65.33±6.65)歲。食管癌臨床分期根據(jù)各項(xiàng)輔助檢查結(jié)果，依照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)食管癌第八版指南綜合判定：TNM分期Ⅰ期35例，Ⅱ期27例，Ⅲ期21例，Ⅳ期20例。食管癌組癌組織直徑<3 cm共38例，≥3 cm共65例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的共30例，未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的共73例。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有組織均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為慢性炎或低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變或高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變或食管鱗狀細(xì)胞癌；均未接受過(guò)放化療及靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他腫瘤轉(zhuǎn)移至食管。

1.3 主要試劑

石蠟包塊取自南通大學(xué)附屬江陰醫(yī)院病理科，免疫組化實(shí)驗(yàn)使用兔單克隆抗體(EPR19270)購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 免疫組化染色

石蠟包塊制成切片，予切片脫蠟，經(jīng)酒精復(fù)水、內(nèi)源過(guò)氧化物酶滅活后將切片于高溫抗原修復(fù)液中修復(fù)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，牛血清白蛋白(BSA)封閉，加入一抗(按說(shuō)明書相應(yīng)抗體稀釋比例操作)孵育過(guò)夜，洗片后加入兔二抗孵育1 h，再次洗片后加入DAB顯色液，顯色30 min后流水沖洗，經(jīng)蘇木精復(fù)染，沖洗后封片。

1.5 觀察及處理

于光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色后切片進(jìn)行觀察，以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒作為陽(yáng)性，使用IMAGE J軟件處理后得到量化的光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。首先對(duì)多組數(shù)值進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，確定方差齊性后采用單因素方差分析多組數(shù)值，并進(jìn)一步使用最小顯著性差異t檢驗(yàn)進(jìn)行事后檢驗(yàn)。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析ATP6V1A的表達(dá)與食管癌患者各病理特征是否相關(guān)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ATP6V1A在食管慢性炎、食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌患者組織中的表達(dá)及其異同

ATP6V1A在食管慢性炎、食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌患者組織中的表達(dá)見圖1、2。處理數(shù)據(jù)得到平均光密度值后進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示方差齊性(P>0.05)，使用單因素方差分析進(jìn)行多組數(shù)據(jù)分析可得平均光密度值在慢性炎組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、食管癌組中逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。在事后檢驗(yàn)組間比較中，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與慢性炎組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，余各組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表1 ATP6V1A平均光密度的比較及分析

表2 事后檢驗(yàn)中對(duì)ATP6V1A平均光密度的比較與分析

圖1 ATP6V1A在食管慢性炎組織(a)、食管低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織(b)、食管高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織(c)、食管鱗狀細(xì)胞癌組織(d)中的表達(dá) ×200

2.2 ATP6V1A與食管癌患者病理特征之間的關(guān)系

食管癌患者共計(jì)103例，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析可得ATP6V1A的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者ATP6V1A表達(dá)高于分期為Ⅰ～Ⅱ期患者(t=3.497，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者ATP6V1A表達(dá)高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(t=3.788，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 ATP6V1A與食管癌患者病理特征之間的關(guān)系

3 討 論

GLOBALCAN 2018的報(bào)告顯示，2018年全球因食管癌死亡人數(shù)在因各類癌癥死亡人數(shù)中排第6位[6]。食管癌具體的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，其臨床癥狀常不典型，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)即為晚期。晚期食管癌治療的效果差，預(yù)后不佳，但食管癌的發(fā)病是由良性病變至上皮內(nèi)瘤變直至癌變的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程。因此，在病變?cè)缙谶M(jìn)行診斷及治療是降低病死率、改善預(yù)后的有效途徑。

目前的研究表明V- ATPase作為一種由ATP驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子泵，與細(xì)胞內(nèi)外酸堿平衡調(diào)節(jié)有關(guān)[7]，且惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與V- ATPase的高表達(dá)有關(guān)[8- 9]。通過(guò)抑制V- ATPase來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)[10- 11]也是近年來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前已有研究介紹了V- ATPase的多個(gè)亞基在口腔癌[12]、胃癌[13]等惡性腫瘤組織中的表達(dá)情況，但目前有關(guān)食管癌的研究較少。

A亞基可提供ATP的結(jié)合位點(diǎn)[2]，也有研究發(fā)現(xiàn)其可以維持溶酶體及溶酶體蛋白酶的功能[14]，是V- ATPase的重要組成部分。因此本研究選擇ATP6V1A作為研究對(duì)象，探究其在食管慢性炎、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、鱗狀細(xì)胞癌組織上的表達(dá)情況及其可能的臨床意義。

圖2 免疫組化染色后各組之間ATP6V1A平均光密度的比較

本研究表明，ATP6V1A從食管慢性炎、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變到高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、食管鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)逐漸升高，根據(jù)這一結(jié)果提示ATP6V1A在食管組織異型增生過(guò)程中可能起到了促進(jìn)作用。進(jìn)一步分組比較發(fā)現(xiàn)，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織與慢性炎組織之間表達(dá)差異不明顯，而高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織及食管鱗狀細(xì)胞癌組織與其相比表達(dá)明顯升高。從而提示，ATP6V1A可以作為食管良惡性病變之間的區(qū)分標(biāo)志，同時(shí)也可以作為鑒別低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變與早期食管癌較為可靠的指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)ATP6V1A的表達(dá)與食管癌患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑無(wú)關(guān)，而與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。ATP6V1A的表達(dá)隨著臨床分期的增高而增加，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)顯著高于未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。結(jié)果提示食管癌患者ATP6V1A的表達(dá)升高，可以作為預(yù)測(cè)食管癌進(jìn)展的指標(biāo)，為治療方案的選擇提供參考。

綜上所述，ATP6V1A與食管癌的進(jìn)展密切相關(guān)，其可以作為一種有價(jià)值的分子標(biāo)志物在食管癌的早期篩查到治療方案選擇等方面作出貢獻(xiàn)。而該亞基在食管癌進(jìn)展中所起的具體作用，尚有待進(jìn)一步分子機(jī)制方面的研究。