畢秋左，錢洲，王月德

曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

肝藏血，主疏泄，心藏神。心血充盈，有助于肝氣疏泄，情志調(diào)暢。肝氣疏泄有度，則心情暢快，利于心神內(nèi)守。若肝郁氣滯，有可能會引起抑郁、乳腺增生、卵巢囊腫等身體病變［1-3］。舒肝調(diào)氣丸具有舒氣開郁，健胃消食功效。用于兩脅脹滿，胸中煩悶，嘔吐惡心，氣逆不順，倒飽嘈雜，消化不良，大便燥結(jié)。處方由香附、厚樸、枳實、龍膽、青皮、陳皮、牡丹皮等21 味藥材組成，其中厚樸主要含有酚性化合物、生物堿及揮發(fā)油等多種化學(xué)成分。厚樸酚、和厚樸酚等酚性化合物是其最主要的活性物質(zhì),其對消化、神經(jīng)、心血管與呼吸系統(tǒng)等均具有明顯的藥理活性及抗炎、抗腫瘤作用等［4］。枳實、青皮、陳皮均屬蕓香科植物，其中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷具有下氣開痞、燥濕化痰、消痞除滿之功效［5-7］。龍膽中的龍膽苦苷具有抗炎、抗癌、利膽的作用［8-11］。牡丹皮作為常用中藥，丹皮酚為主要有效成分，具有保肝、護(hù)腎、清熱等藥理作用［12］。舒肝調(diào)氣丸收錄于中成藥部頒標(biāo)準(zhǔn)第八冊WS3-B-1650-93，標(biāo)準(zhǔn)中無含量測定項目，且舒肝調(diào)氣丸含量測定的相關(guān)文獻(xiàn)報道較少，本文采用多指標(biāo)成分超高效液相色譜（UPLC）梯度洗脫法，首次對舒肝調(diào)氣丸中龍膽、厚樸、枳實、青皮、陳皮、牡丹皮等藥材中的7 個指標(biāo)成分進(jìn)行定量測定，即建立UPLC 法同時測定龍膽苦苷、厚樸酚、和厚樸酚、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、丹皮酚的含量，報告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型液相色譜儀，包括二元泵，DAD檢測器，自動進(jìn)樣器。電子天平：MS205DU 型（精度為十萬分之一）。KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

龍膽苦苷對照品（批號：110770-201918，純度97.1%）；丹皮酚對照品（批號：110708-201908，純度99.8%）；柚皮苷對照品（批號：110722-201714，純度93.4%）；橙皮苷對照品（批號：110721-201818，純度96.2%）；新橙皮苷對照品（批號：111857-201703，純度99.2%）；和厚樸酚對照品（批號：110730-201614，純度 99.3%）；厚樸酚對照品（批號：110729-201714，純度100%）均購自中國食品藥品檢定研究院。舒肝調(diào)氣丸（天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格：5 g/袋，批號分別為0980201、080204、0980210）。水為超純水，甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：依利特Hypersil ODS2 柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相:甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～3 min，20%A；3～10 min，20%→25%A；1 0～4 0 min，2 5% → 3 5%A ；4 0～4 5 min，35% →63%A；45～60 min，63%A；60～61 min，63%A；61～63 min，20%A）；流速:1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液精密稱取各對照品適量，置25 mL 量瓶中，加甲醇配制成含龍膽苦苷123.12 μg/mL、丹皮酚34.40 μg/mL、柚皮苷294.40 μg/mL、橙皮苷616.06 μg/mL、新橙皮苷645.99 μg/mL、和厚樸酚225.21 μg/mL、厚樸酚209.60 μg/mL 的混合對照品儲備溶液。精密量取3.5 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋制成含龍膽苦苷17.24 μg/mL、丹皮酚4.82 μg/mL、柚皮苷41.22 μg/mL、橙皮苷86.25 μg/mL、新橙皮苷90.44 μg/mL、和厚樸酚31.53 μg/mL、厚樸酚29.34 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取舒肝調(diào)氣丸，研細(xì)，混勻，稱取樣品約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲（300 W，50 kHz）處理45 min，放冷，用50% 甲醇補足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 的微孔濾膜濾過，備用。

2.2.3 陰性樣品溶液按照舒肝調(diào)氣丸中的處方比例及制備工藝，制備不含龍膽、牡丹皮、枳實、白芍、青皮、陳皮、厚樸及厚樸花的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗分別取“2.2”項下各溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果龍膽苦苷、丹皮酚、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的理論板數(shù)及分離度均較好（理論板數(shù)＞10 000，分離度＞1.5），陰性樣品對供試品檢測無干擾。混合對照品、供試品及陰性樣品色譜圖如圖1。

圖1 UPLC色譜圖：A.對照品；B.樣品；C.陰性樣品

2.3.2 線性關(guān)系考察精密量取“2.2.1”項下混合對照品儲備溶液0.4、0.8、1.5、3.0、4.0 mL，分別置10 mL 量瓶中,用50%甲醇稀釋至刻度，按“2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣測定。結(jié)果見表1。

表1 7種成分的線性關(guān)系

2.3.3 精密度試驗取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果龍膽苦苷、丹皮酚、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚峰面積RSD 分別為 0.83%，1.52%，1.31%，1.66%，0.79%，0.84%，1.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液（批號：0980201），分別于室溫下放置0，4，8，12，16，20，24 h 后按“2.1”項下色譜條件測定。結(jié)果龍膽苦苷、丹皮酚、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚面積無明顯變化，RSD 分別為0.92%，1.33%，1.41%，1.52%，0.88%，1.06%，1.68%（n=7），表明供試品溶液中7 個成分在室溫條下放置24 h 穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗取同一批供試品（批號：0980201）6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果龍膽苦苷、丹皮酚、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚平均含量分別為2.253 1、0.520 4、4.796 5、12.169 8、11.352 7、3.468 2、3.556 1 mg/g，RSD 分別為0.65%，1.05%，1.04%，1.15%，0.61%，0.76%，1.23%（n=6），表明本法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗取已知含量的供試品（批號：0980201）6 份，每份約0.1 g，分別精密加入“2.2.1”項下混合對照品儲備溶液2.0 mL，按“2.2.2”項下方法制備加樣回收樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下測定，計算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 樣品提取條件及流動相的選擇

結(jié)合參考文獻(xiàn)［13-17］，以超聲提取為基礎(chǔ)，依次考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇為提取溶劑，提取時間30 min，45 min，60 min，結(jié)果顯示以甲醇為溶劑時，龍膽苦苷峰形不好，70%甲醇和50%甲醇提取效果無明顯差別，且提取時間為45 min 時各組分提取較完全，回收率較好。以甲醇-水作為流動相梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)各成分峰分離度好，基線噪音小，且配制簡單方便。因此本實驗選擇用50%甲醇超聲提取45 min，并用甲醇-水作為流動相。

3.2 檢測波長的選擇

采用DAD 檢測器在190～400 nm 波長段分別掃描7 個活性成分的對照品溶液和供試品溶液，結(jié)果表明 7 個成分最大吸收波長均不同，在270 nm 處供試品溶液中7 個成分均有較好吸收，故本實驗選擇270 nm 作為檢測波長，保證各成分的靈敏度和精密度達(dá)到最佳效果。

4 小結(jié)

根據(jù)三批樣品含量測定結(jié)果的差異性可得，建立舒肝調(diào)氣丸中龍膽苦苷、丹皮酚、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚7 個成分同時測定的方法，采用UPLC 法分析操作簡便，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，為舒肝調(diào)氣丸多成分質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。