朱景茹,洪銀潔,黃婉儀,張 斐,涂文玲,楊宗保,甘慧娟*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)證基地,福州 350122;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院,福州 350122;3.廈門大學(xué)中醫(yī)系,福建 廈門 361102)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是臨床常見的胃癌前期疾病,可見胃黏膜組織病理萎縮、變薄,是“炎癌轉(zhuǎn)化”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。大量臨床研究證實,柴芍六君湯對CAG患者有顯著療效,可以確切改善胃脘部不適癥狀,逆轉(zhuǎn)病理萎縮,促進疾病向愈[2-4]。然而,柴芍六君湯防治CAG的整體調(diào)節(jié)機制尚未得到充分揭示,因此,有必要從分子生物學(xué)角度深入研究柴芍六君湯對肝郁脾虛型CAG大鼠胃黏膜細(xì)胞增殖、凋亡的影響,為中藥防治CAG、阻斷其向胃癌進展的臨床應(yīng)用提供科學(xué)實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠,8周齡,26只,雌雄各半,體重(200±20)g,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2019-0005]。大鼠群養(yǎng)于墊玉米芯的飼料籠中,墊料4 d更換1次,雌雄分籠飼養(yǎng),控制室溫21℃~23℃,相對濕度50%,自由攝食飲水,在廈門大學(xué)動物實驗中心[SYXK(閩)2018-0009]適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進行分組實驗。本實驗經(jīng)廈門大學(xué)實驗動物管理倫理委員會批準(zhǔn)(XMULAC20190142),實驗過程嚴(yán)格遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

脫氧膽酸鈉(批號:20190901,北京奧博星生物技術(shù));25%~28%氨水(批號:C10586777,上海百舜生物科技);維酶素片(批號:20190405,樂普恒久遠藥業(yè));HE染色試劑盒(批號:J19S11Y125305,上海源葉生物科技);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:AJ52623A,日本TaKaRa公司);PCNA抗體(貨號:24036,美國Proteintech公司);Ag-NOR染色液(貨號:G2015,北京索萊寶科技);TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號:C1088,上海碧云天生物技術(shù));基因擴增儀、熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司);正置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司);半自動切片機(德國Leica公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物制備

維酶素混懸液:給藥前用蒸餾水配制混懸液,按照大鼠是人常規(guī)劑量的6倍計算[5],給藥量為240 mg/(kg·d)。柴芍六君湯出自《醫(yī)宗金鑒》,組方:北柴胡6 g,人參9 g,白芍4.5 g,白術(shù)9 g,茯苓9 g,法半夏4.5 g,制陳皮6 g,炙甘草3 g,飲片由閩侯上街致誠醫(yī)藥商店提供,經(jīng)鑒定為質(zhì)量合格的中藥飲片。常規(guī)煎煮2次后混勻,濃縮成含生藥量0.51 g/mL中藥湯劑,無菌紗布過濾后分裝入瓶,4℃冰箱儲存。

1.3.2 分組、造模與處理

26只大鼠根據(jù)Excel隨機生成數(shù)字分為2組,即正常組6只和造模組20只。正常組不予處理,造模組采用復(fù)合因素造模法[6-7]建立肝郁脾虛型CAG大鼠模型:大鼠予每日現(xiàn)配的20 mmol/L脫氧膽酸鈉溶液和0.1%氨水溶液交替自由飲用,配合2 d足食、1 d禁食的饑飽失常法,每日夾尾激惹1 h,造模10周。造模組每5周隨機抽取1只大鼠進行造模評價,取材胃黏膜組織觀察形態(tài)色澤、皺壁厚薄及病理形態(tài),結(jié)合大便性狀、毛發(fā)色澤、精神狀況及強迫游泳實驗等結(jié)果綜合判斷。將成模大鼠隨機分為3組,即模型組、維酶素組和柴芍六君湯組,每組6只。柴芍六君湯組予柴芍六君湯5.1 g/(kg·d),維酶素組予維酶素混懸液240 mg/(kg·d),正常組和模型組予滅菌飲用水,按體重10 mL/kg灌胃,干預(yù)4周后取材。修剪胃黏膜組織周邊多余脂肪,生理鹽水漂洗后觀察胃黏膜形態(tài)色澤、皺壁厚薄,取胃竇部固定于4%多聚甲醛溶液中24 h,胃體部凍存-80℃冰箱備用。

1.3.3 胃黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察

胃黏膜組織經(jīng)流水沖洗6 h后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋后切片,切片厚度約4μm,63℃烘片機烤片4 h,脫蠟后行HE染色,顯微鏡觀察胃黏膜組織病理結(jié)構(gòu)變化。

1.3.4 qPCR法檢測胃黏膜凋亡基因c-myc和p53 mRNA水平

引物序列5’-3’:c-myc:F-TCTCCGTCCTATG TTGCG,R-GGCTGGTGCTGTCTTTGC;p53:F-GCGTT GCTCGATGGTGA,R-CAGCGTGATGATGGTAAGG;βactin:F-CTGGCTCCTAGCACCATGAA,R-AAAACGC AGCTCAGTAACAGTC。引物由上海百賽生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成。TRIzol法提取胃黏膜組織總RNA并進行濃度測試,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后按照說明書配制反應(yīng)體系,放入熒光定量PCR儀進行qPCR反應(yīng),記錄各組CT值,采用2-△△Ct計算方法進行統(tǒng)計分析。

1.3.5 IHC法檢測PCNA和Ag-NOR含量

胃黏膜組織切片、脫蠟、水化后進行熱抗原修復(fù),10%山羊血清室溫封閉1 h,一抗37℃孵育1 h,PBS漂洗4次,加入二抗37℃孵育1 h,PBS漂洗10次,DAB顯色,蘇木素復(fù)染后流水沖洗30 min,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片后顯微鏡觀察。運用軟件Image J v1.8.0進行平均光密度(IOD/area)分析。

1.3.6 TUNEL法檢測胃黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)

胃黏膜組織脫蠟,蛋白酶K消化,按照說明書配制TUNEL試劑,加檢測液37℃避光孵育1 h,PBS漂洗3次,用抗熒光淬滅的封片液封片,綠色熒光發(fā)射波長為515~565 nm,顯微鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞個數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

運用軟件SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析,計量資料屬正態(tài)分布用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,反之則用M(P25,P75)表示。多組比較符合正態(tài)分布采用單因素方差分析,組間比較不符合正態(tài)分布用秩和檢驗。按α=0.05檢驗水準(zhǔn),以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型評價

正常組大鼠活潑喜動,好奇心強,毛發(fā)潔白光澤,大便色褐且無明顯臭味;胃黏膜組織形態(tài)正常,上皮細(xì)胞完整無缺損,固有腺體整齊規(guī)則。造模組大鼠毛發(fā)淡黃質(zhì)硬,神態(tài)疲倦,大便味臭,溏結(jié)不調(diào);胃黏膜組織固有腺體萎縮,炎性細(xì)胞浸潤,主細(xì)胞和壁細(xì)胞減少;強迫游泳靜止時間較正常組明顯延長(P＜0.01)。見表1。

表1 兩組大鼠強迫游泳靜止時間比較M(P25,P75)Table 1 Comparison of static time in forced swimming of rats in two groups M(P25,P75)

2.2 大鼠一般情況比較

正常組大鼠毛發(fā)潔白光澤,活躍好奇,精力充沛,灌胃抵抗較明顯;模型組大鼠毛發(fā)蓬松無光澤,色淡黃質(zhì)硬,神態(tài)仍稍疲憊,偶見安靜扎堆,反應(yīng)較遲鈍,灌胃時溫順不抵抗;維酶素組大鼠毛發(fā)蓬松,少有光澤,活潑警惕,灌胃偶有抵抗;柴芍六君湯組大鼠毛發(fā)淡黃質(zhì)硬,稍有光澤,活潑好動,灌胃抵抗。

2.3 大鼠胃黏膜組織形態(tài)學(xué)比較

正常組大鼠胃黏膜組織顏色鮮紅,色澤光亮,黏膜皺襞豐富充盈,形態(tài)正常;光鏡下可見組織結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞排列緊密整齊,未見細(xì)胞壞死。模型組大鼠胃黏膜組織顏色稍灰暗,厚度變薄,色澤較差,皺襞減少甚至消失;固有腺體萎縮,炎性細(xì)胞浸潤,部分細(xì)胞脫落、壞死,排列紊亂。維酶素組大鼠胃黏膜組織色澤鮮紅,胃黏膜厚度較模型組增厚,黏膜皺襞增加;胃黏膜形態(tài)較模型組改善,炎性細(xì)胞浸潤減輕,腺腔仍較大,細(xì)胞排列較整齊。柴芍六君湯組大鼠胃黏膜形態(tài)趨向于正常組,胃黏膜未見充血水腫,黏膜皺襞明顯增多,厚度較厚;固有腺體萎縮改善,黏膜層連續(xù)完整,腺腔體積小,少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 大鼠胃黏膜組織直觀圖與組織病理圖(HE染色)Figure 1 Visual and histopathological images of gastric mucosa in rats(HE staining)

2.4 大鼠胃黏膜凋亡基因c-myc和p53比較

與正常組比,模型組大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達均顯著上升(P＜0.01);維酶素組和柴芍六君湯組大鼠胃黏膜p53 mRNA表達上升(P＜0.05或P＜0.01),c-myc mRNA表達較正常組均有上升趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組比,維酶素組和柴芍六君湯組大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達均下降(P＜0.05或P＜0.01)。與維酶素組比,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達均有上升趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。這說明柴芍六君湯和維酶素均能抑制肝郁脾虛型CAG大鼠胃黏膜細(xì)胞過度凋亡且作用基本一致。見表2,圖2。

表2 大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡基因c-myc和p53比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of apoptosis genes c-myc and p53 in gastric mucosa of rats

表2 大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡基因c-myc和p53比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of apoptosis genes c-myc and p53 in gastric mucosa of rats

注:與 正 常 組 比 較,a P＜0.05,b P＜0.01;與 模 型 組 比 較,c P＜0.05,d P＜0.01。Note.Compared with the normal group,a P＜0.05,b P＜0.01.Compared with the CAG group,c P＜0.05,d P＜0.01.

組別Groups c-myc p53正常組Normal group 1.06±0.361.06±0.38模型組CAG group 11.42±3.21b 17.26±6.28b維酶素組VI group 3.44±1.62d 5.80±1.85bc柴芍六君湯組CS group 4.08±2.58d 7.43±2.85ac

圖2 大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡基因c-myc及p53電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of apoptosis genes c-myc and p53 in rat gastric mucosa

2.5 大鼠胃黏膜增殖因子PCNA和Ag-NOR比較

與正常組比,模型組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達均上升(P＜0.05或P＜0.01),維酶素組大鼠胃黏膜PCNA蛋白表達顯著上升(P＜0.01),柴芍六君湯組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達均有上升趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組比,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達均上升(P＜0.05或P＜0.01),維酶素組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達較模型組有下降趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與維酶素組比,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR表達均有下降趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。這提示柴芍六君湯在抑制肝郁脾虛型CAG大鼠胃黏膜細(xì)胞過度增殖方面的效果要優(yōu)于維酶素。見表3,圖3。

圖3 大鼠胃黏膜PCNA和Ag-NOR表達量Note.PCNA, Proliferating cell nuclear antigen.Ag-NOR,Argyrophilic nucleolar organizer region protein.Compared with the normal group, a P＜0.05,b P＜0.01.Compared with the CAG group,c P＜0.05,d P＜0.01.Figure 3 Expression of PCNA and Ag-NOR in gastric mucosa of rats

表3 大鼠胃黏膜細(xì)胞增殖因子PCNA和Ag-NOR表達量比較(±s,n=6)Table 3 Comparison of PCNA and Ag-NOR expression in gastric mucosa of rats

表3 大鼠胃黏膜細(xì)胞增殖因子PCNA和Ag-NOR表達量比較(±s,n=6)Table 3 Comparison of PCNA and Ag-NOR expression in gastric mucosa of rats

注:與正常組比較,a P＜0.05,b P＜0.01;與模型組比較,c P＜0.05,d P＜0.01。Note.Compared with the normal group,a P＜0.05,b P＜0.01.Compared with the CAG group,c P＜0.05,d P＜0.01.

組別Groups PCNA Ag-NOR正常組Normal group 0.58±0.100.46±0.14模型組CAG group 0.83±0.12b 0.64±0.16a維酶素組VI group 0.73±0.14b 0.54±0.12柴芍六君湯組CS group 0.61±0.77d 0.47±0.77c

2.6 大鼠胃黏膜凋亡指數(shù)比較

與正常組比,模型組大鼠胃黏膜凋亡指數(shù)上升(P＜0.05)。與模型組比,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜凋亡指數(shù)下降(P＜0.05),維酶素組大鼠胃黏膜凋亡指數(shù)較模型組有下降趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與維酶素組比,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜凋亡指數(shù)有下降趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。這表明柴芍六君湯對肝郁脾虛型CAG大鼠胃黏膜細(xì)胞過度凋亡具有抑制作用。見表4,圖4。

表4 大鼠胃黏膜凋亡指數(shù)比較(±s,n=6)Table 4 Comparison of gastric mucosal apoptosis index in rats

表4 大鼠胃黏膜凋亡指數(shù)比較(±s,n=6)Table 4 Comparison of gastric mucosal apoptosis index in rats

注:與正常組比較,a P＜0.05;與模型組比較,b P＜0.05。Note.Compared with the normal group,a P＜0.05.Compared with the CAG group,b P＜0.05.

組別Groups凋亡指數(shù)(%)Apoptosis index正常組Normal group 0.19±0.07模型組CAG group 0.64±0.21a維酶素組VI group 0.39±0.16柴芍六君湯組CS group 0.19±0.51b

圖4 大鼠胃黏膜凋亡情況Figure 4 Apoptosis of gastric mucosa in rats

3 討論

胃癌發(fā)病率和死亡率均居我國惡性腫瘤第3位,嚴(yán)重威脅人類生命健康,CAG是由于多種致病因素關(guān)聯(lián)作用于機體后出現(xiàn)胃黏膜侵襲與防御因素失衡的胃黏膜損傷性疾病,與胃癌的發(fā)病率呈正相關(guān)[8-10],因此,對CAG采取早期干預(yù)措施,防止甚至逆轉(zhuǎn)腸化生與上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生,是阻斷胃癌進展的重要手段。中醫(yī)認(rèn)為脾胃虛弱是CAG的發(fā)病基礎(chǔ),氣滯亦為本病核心,課題組前期研究表明,肝郁脾虛是CAG重要病理特點,二者常相互影響導(dǎo)致CAG的發(fā)病,又因氣滯不行或脾虛不運,妨礙津液正常運行,以致痰聚濕阻,日久易致癌變[11]。肝郁脾虛型病證結(jié)合動物模型一直是中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究的熱點和特色理論,有學(xué)者從宏觀表征、行為學(xué)以及理化指標(biāo)方面進行模型評價[12]。本實驗造模結(jié)束后,造模組大鼠病理可見胃黏膜固有腺體萎縮,明顯炎性細(xì)胞浸潤;一般行為觀察出現(xiàn)毛發(fā)色黃質(zhì)硬,神態(tài)疲倦,大便溏結(jié)不調(diào),安靜扎堆,行為抑郁,強迫游泳靜止時間明顯延長,上述表現(xiàn)較符合肝郁脾虛型CAG的生物學(xué)特征,提示模型成功建立。柴芍六君湯是臨床治療肝郁脾虛型CAG的經(jīng)典方劑,具有疏肝健脾化痰的作用,經(jīng)本方治療后,模型大鼠可見精神狀態(tài)好轉(zhuǎn),活動度增加,胃黏膜皺襞明顯增多、固有腺體萎縮改善、少量炎性細(xì)胞浸潤。本實驗結(jié)果提示,柴芍六君湯能夠明顯改善肝郁脾虛型CAG大鼠的精神及活動狀態(tài),促進胃黏膜組織損傷修復(fù)。

CAG發(fā)生發(fā)展過程中涉及胃黏膜細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂和多基因表達異常,細(xì)胞增殖、凋亡失衡是CAG發(fā)生的關(guān)鍵因素之一,有研究指出,促凋亡基因c-myc和p53等異常表達均可能參與癌變的某個環(huán)節(jié)[13-14]。c-myc作為原癌基因磷酸化蛋白質(zhì),能夠直接控制DNA的合成,在細(xì)胞凋亡、分化、黏附以及細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用,可以維持胃癌細(xì)胞的惡性表型,在CAG甚至胃癌中存在過表達情況[15]。p53是腫瘤抑制基因,能夠監(jiān)護細(xì)胞基因的完整性,其蛋白活化水平的增加可降低細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)的閾值,癌組織分化越差,p53異常表達的分布就越廣泛[16]。本實驗結(jié)果顯示,模型組大鼠存在胃黏膜細(xì)胞過度凋亡的表現(xiàn),凋亡基因c-myc、p53以及凋亡指數(shù)表達均升高,經(jīng)藥物干預(yù)后,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達和凋亡指數(shù)均下降,維酶素組大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達下降,凋亡指數(shù)有下降趨勢但無統(tǒng)計學(xué)差異,提示柴芍六君湯和維酶素都能夠有效抑制CAG大鼠胃黏膜細(xì)胞的過度凋亡,下調(diào)胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達水平,從而起到治療肝郁脾虛型CAG的作用。

PCNA主要參與細(xì)胞DNA復(fù)制、修復(fù)及細(xì)胞周期調(diào)控等多個重要環(huán)節(jié),其含量反映出細(xì)胞的生長速度及狀態(tài),對胃癌癌前病變的診斷、分級、指導(dǎo)治療、預(yù)后轉(zhuǎn)歸具有實用性價值,是具有代表性的細(xì)胞增殖標(biāo)記物[17]。Ag-NOR含量取決于轉(zhuǎn)錄活動的水平和染色體組中攜帶NOR染色體的數(shù)量,細(xì)胞增殖活躍導(dǎo)致Ag-NOR大量增加,細(xì)胞中Ag-NOR的含量對胃黏膜變異程度研究有著重要意義[18]。IHC檢測結(jié)果證實,模型組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白存在高表達,經(jīng)藥物干預(yù)后,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達水平均出現(xiàn)不同程度的下降,維酶素組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達有下降趨勢但無統(tǒng)計學(xué)差異,表明柴芍六君湯能夠?qū)Ω斡羝⑻撔虲AG大鼠胃黏膜細(xì)胞的過度增殖起抑制作用,且相較于陽性藥物維酶素具有更大的治療優(yōu)勢。

綜上所述,柴芍六君湯對肝郁脾虛型CAG大鼠精神狀態(tài)和病理形態(tài)具有明顯改善作用,且能夠下調(diào)胃黏膜c-myc、p53 mRNA和PCNA、Ag-NOR蛋白表達水平,抑制胃黏膜細(xì)胞過度增殖、凋亡。因此認(rèn)為,柴芍六君湯對肝郁脾虛型CAG大鼠的整體治療作用可能與調(diào)控胃黏膜細(xì)胞過度增殖、凋亡,從而使其增殖、凋亡水平趨向于平衡狀態(tài)有關(guān)。此外,是否還涉及其他更多增殖凋亡基因參與或者信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,還需要進一步驗證。