索紅亮,孫治霞,曾垂義,張文宗,毛德西

(1.河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院)心病科,鄭州 450002;2.河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院)重癥醫(yī)學科,鄭州 450002;3.河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院)名醫(yī)堂,鄭州 450002)

經皮冠狀動脈(冠脈)支架術是治療冠心病的有效手段,但近來研究發(fā)現(xiàn),患者術后血心肌酶譜,如心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB,CKMB)等可出現(xiàn)顯著升高,表明冠脈侵入性治療可造成心肌損傷,即冠脈侵入性損傷,而心肌缺血再灌注模型可以模擬冠脈侵入性損傷情況[1-2],因此采用心肌缺血再灌注模型模擬冠脈侵入性損傷,深入探究其發(fā)生機理,對尋找有效途徑以改善患者預后至關重要。五參順脈膠囊(Wushen-Shunmai capsule)可顯著改善心肌梗死及心絞痛等癥狀,本課題組前期大鼠實驗研究證實,五參順脈膠囊用于改善心肌缺血再灌注損傷的作用較明顯,可能與內質網應激介導的細胞凋亡有關[3]。而磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號通路作為抗凋亡中經典通路之一,其下游分子-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)則為調節(jié)自噬的關鍵蛋白,研究顯示,自噬性細胞死亡在缺血再灌注導致的心肌損傷中亦發(fā)揮重要作用[4-5]。因此,本研究擬通過心肌缺血再灌注損傷模型,基于PI3K/Akt介導的自噬信號通路,進一步深入探究五參順脈膠囊對模型大鼠改善的作用機制,以期為其臨床合理應用予以依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60只雄性,6周齡SPF級SD大鼠,體重(200±20)g,購自斯萊克實驗動物有限公司(上海)[SCXK(滬)2017-0005],在河南省中醫(yī)院實驗室飼養(yǎng)[SYXK(豫)2016-0009]。整個實驗飼養(yǎng)條件為自由采食及飲水,12 h/12 h光照/黑暗條件下正常飼養(yǎng),溫度約25℃,相對濕度45%~65%。本研究的動物實驗經河南省中醫(yī)院動物倫理委員會批準(IACUC-20190417),并遵守審批內容實施,實驗符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

五參順脈膠囊購自河南省中醫(yī)院,丟棄膠囊殼,藥物取出后用羧甲基纖維素鈉制成含生藥100 g/L混懸液使用。抑制劑LY294002(貨號:L9908)購自美國Sigma公司;大鼠cTnI ELISA試劑盒(貨號:ab246529)、CK-MB ELISA試劑盒(貨號:ab193696)、兔源一抗anti-微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)(貨號:ab192890)、anti-PI3K(貨號:ab32089)、antip-PI3K(貨 號:ab182651)、anti-AKT(貨 號:ab235958)、anti-p-AKT(貨號:ab38449)、anti-mTOR(貨號:ab109268)、anti-p-mTOR(貨號:ab2732)、anti-天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartase-3,caspase3)(貨號:ab13847)、anti-Bcl2相關X蛋白(Bcl2 associated X protein,Bax)(貨號:ab32503)、anti-B 淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl2)(貨 號:ab182858)、anti-β-actin(貨號:ab8227),二抗羊抗兔IgG(貨號:ab6721)均購自英國Abcam公司;FC型酶標儀、Themis透射電子顯微鏡均購自美國ThermoFisher公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

參考文獻[6]制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型,SD大鼠術前腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,固定于手術臺,腹部常規(guī)消毒后,打開胸腔,暴露心臟,于冠狀動脈左前降支分支處穿入結扎線并套入一塑料管進行冠脈結扎,缺血30 min,心臟血液再灌流180 min,之后關閉胸腔、逐層縫合。

1.3.2 動物分組及給藥

成模SD大鼠隨機分為模型組、五參順脈膠囊組、自噬抑制劑組(五參順脈膠囊+LY294002組),每組15只,另取15只為假手術組(Sham組),處理方法與模型組相同,但不進行冠脈結扎。五參順脈膠囊組灌胃0.9 g/kg五參順脈膠囊[3],自噬抑制劑組于尾靜脈注射LY2940020.3 mg/kg聯(lián)合灌胃0.9 g/kg五參順脈膠囊,假手術組與模型組均灌胃等量羧甲基纖維素鈉溶劑,每天1次,連續(xù)2周。

1.3.3 血清cTnI、CK-MB蛋白濃度檢測

給藥結束后,尾靜脈采血,離心后取上清。血清cTnI、CK-MB蛋白濃度以酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測,具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 心肌梗死體積測定

各組5只大鼠處死,暴露心臟,取梗死區(qū)心肌組織以0.5 m厚度進行冰凍切片,置于預熱的2%2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)溶液中,37℃孵育20 min至梗死區(qū)呈紅色,棄去TTC溶液,添加4%多聚甲醛固定,拍照,以梗死區(qū)/危險區(qū)×100%記為梗死區(qū)比例(%)。

1.3.5 電鏡觀察心肌組織細胞自噬體形成數(shù)量

另取部分心肌組織,采用戊二醛-鋨酸法雙重固定,制備超薄切片,進行醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙染,透射電鏡下觀察心肌細胞中自噬體結構及數(shù)量,每個樣本計數(shù)最終自噬體形成數(shù)量為3個銅網孔(每孔約30000平方微米)內自噬體數(shù)量平均值。

1.3.6 心肌組織中LC3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、caspase3、Bax、Bcl2蛋白表達水平檢測

提取心肌組織總蛋白并測定蛋白濃度,隨后行SDS-PAGE電泳分離,轉膜、室溫封閉、一抗孵育,再分別添加anti-LC3(1∶2000)、anti-PI3K(1∶1000)、anti-p-PI3K(1∶1000)、anti-Akt(1∶1000)、anti-p-Akt(1∶1000)、anti-mTOR(1∶2000)、anti-p-mTOR(1∶1000)、caspase3(1∶1000)、Bax(1∶2000)、Bcl2(1∶1000)、anti-β-actin(1∶5000)4℃孵育過夜,二抗IgG(1∶5000)37℃孵育1 h,洗膜后顯色、拍照并觀察各蛋白條帶灰度值。

1.3.7 心肌細胞凋亡檢測

各組另取10只大鼠處死,固定部分心肌梗死組織,石蠟包埋后切片。原位末端標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色,各項步驟均具體操作嚴格按照TUNEL凋亡檢測試劑盒附帶說明書進行,最后進行DAB顯色,蘇木素復染、透明、封片。若呈棕褐色則為陽性凋亡細胞,呈藍紫色為未凋亡細胞。每張切片于高倍鏡下隨機選取10個視野進行陽性細胞計數(shù),凋亡指數(shù)(%)為陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法

SPSS 25.0統(tǒng)計分析。所得結果用平均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較單因素方差(one-way AVOVA)分析,兩兩間比較SNK-q分析,若P＜0.05則表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清心肌酶譜水平比較

與假手術組比,模型組大鼠血清cTnI、CK-MB濃度增加(P＜0.05);與模型組比較,五參順脈膠囊組大鼠血清cTnI、CK-MB濃度降低(P＜0.05);與五參順脈膠囊組比較,自噬抑制劑組大鼠血清cTnI、CK-MB濃度增加(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清cTnI、CK-MB濃度比較(±s,n=15)Table 1 Comparison of serum cTnI and CK-MB in rats of each group

表1 各組大鼠血清cTnI、CK-MB濃度比較(±s,n=15)Table 1 Comparison of serum cTnI and CK-MB in rats of each group

注:與假手術組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05;與五參順脈膠囊組比較,&P＜0.05。Note.Compared with sham group,*P＜0.05.Compared with model group,#P＜0.05.Compared with Wushen-Shunmai capsule group,&P＜0.05.

組別Groups cTnI(ng/mL)CK-MB(U/L)假手術組Sham group 0.18±0.02716.84±142.39模型組Model group 0.76±0.08* 2069.75±196.58*五參順脈膠囊組Wushen-Shunmai capsule group 0.51±0.04# 1132.46±163.32#自噬抑制劑組Autophagy inhibitor group 0.63±0.07& 1892.91±178.21&

2.2 各組大鼠心肌梗死區(qū)比例及自噬體數(shù)量比較

假手術組形態(tài)正常,未見線粒體腫脹;模型組線粒體腫脹明顯、自噬泡數(shù)量增多;五參順脈膠囊組出現(xiàn)部分線粒體腫脹現(xiàn)象、可觀察到自噬泡;自噬抑制劑組與模型組類似。與假手術組比較,模型組大鼠心肌梗死區(qū)比例、自噬體數(shù)量增加(P＜0.05);與模型組比較,五參順脈膠囊組大鼠心肌梗死區(qū)比例、自噬體數(shù)量降低(P＜0.05);與五參順脈膠囊組比較,自噬抑制劑組大鼠心肌梗死區(qū)比例、自噬體數(shù)量增加(P＜0.05)。見圖1、圖2、表2。

表2 各組大鼠心肌梗死區(qū)比例及自噬體數(shù)量比較(±s)Table 2 Comparison of myocardial infarction area proportion and cardiomyocytes number of rats in each group

表2 各組大鼠心肌梗死區(qū)比例及自噬體數(shù)量比較(±s)Table 2 Comparison of myocardial infarction area proportion and cardiomyocytes number of rats in each group

注:與假手術組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05;與五參順脈膠囊組比較,&P＜0.05。Note.Compared with sham group,*P＜0.05.Compared with model group,#P＜0.05.Compared with Wushen-Shunmai capsule group,&P＜0.05.

組別Groups梗死區(qū)比例(%)(n=5)Proportion of infarct area自噬體數(shù)量(個)(n=10)Number of autophagosomes假手術組Sham group 0.13±0.027.14±1.42模型組Model group 39.75±2.86* 24.67±4.18*五參順脈膠囊組Wushen-Shunmai capsule group 15.24±2.01# 12.36±2.25#自噬抑制劑組Autophagy inhibitor group 27.96±2.85& 18.86±3.47&

圖1 各組大鼠心肌梗死區(qū)情況Note.A,Sham group.B,Model group.C,Wushen-Shunmai capsule group.D,Autophagy inhibitor group.Figure 1 Situation of myocardial infarction area in each group of rats

圖2 各組大鼠心肌細胞自噬體情況Figure 2 Autophagosomes of rat cardiomyocytes in each group

2.3 各組大鼠心肌組織LC3蛋白表達水平比較

與假手術組比較,模型組大鼠心肌組織LC3-II/LC3-I增加(P＜0.05);與模型組比較,五參順脈膠囊組大鼠心肌組織LC3-II/LC3-I降低(P＜0.05);與五參順脈膠囊組比較,自噬抑制劑組大鼠心肌組織LC3-II/LC3-I增加(P＜0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織LC3蛋白表達水平比較Note.A,Sham group.B,Model group.C,Wushen-Shunmai capsule group.D,Autophagy inhibitor group.Compared with sham group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Compared with Wushen-Shunmai capsule group,&P＜0.05.Figure 3 Comparison of LC3 protein expression in myocardium of rats in each group

2.4 各組大鼠心肌組織PI3K、Akt、mTOR及其磷酸化蛋白表達水平比較

與假手術組比較,模型組大鼠心肌組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平降低(P＜0.05);與模型組比較,五參順脈膠囊組大鼠心肌組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平增加(P＜0.05);與五參順脈膠囊組比較,自噬抑制劑組大鼠心肌組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平降低(P＜0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠心肌組織PI3K、Akt、mTOR及其磷酸化蛋白表達Note.A,Sham group.B,Model group.C,Wushen-Shunmai capsule group.D,Autophagy inhibitor group.The same as below.Figure 4 Expression of PI3K,Akt,mTOR and their phosphorylated proteins in myocardium of rats in each group

2.5 各組大鼠心肌組織caspase3、Bax、Bcl2蛋白表達水平比較

與假手術組比較,模型組大鼠心肌組織caspase3、Bax水平升高,Bcl2水平降低(P＜0.05);與模型組比較,五參順脈膠囊組大鼠心肌組織caspase3、Bax水平降低,Bcl2水平升高(P＜0.05);與五參順脈膠囊組比較,自噬抑制劑組大鼠心肌組織caspase3、Bax水平升高,Bcl2水平降低(P＜0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織caspase3、Bax、Bcl2蛋白表達Figure 5 Expression of caspase3、Bax、Bcl2 proteins in myocardium of rats in each group

2.6 各組大鼠凋亡情況比較

與假手術組比較,模型組大鼠凋亡指數(shù)增加(P＜0.05);與模型組比較,五參順脈膠囊組大鼠凋亡指數(shù)降低(P＜0.05);與五參順脈膠囊組比較,自噬抑制劑組大鼠凋亡指數(shù)增加(P＜0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠心肌梗死區(qū)凋亡情況Figure 6 Apoptosis in myocardial infarction area of rats in each group

3 討論

多項研究顯示,冠脈介入手術亦存在風險,可損傷血管內皮,造成炎癥的發(fā)生,甚至導致心肌缺血再灌注損傷[7-8]。本研究造模后顯示,與假手術組比較,模型組大鼠血清cTnI、CK-MB濃度、心肌梗死區(qū)比例均增加,心肌細胞受損時可導致心肌酶釋放入血,血清cTnI、CK-MB濃度是反映心肌損傷的標志性酶[9],心肌梗死區(qū)比例則可直觀評價心肌損傷,提示模型制備成功。五參順脈膠囊最早由全國名老中醫(yī)毛德西教授創(chuàng)立,該方以益氣養(yǎng)陰為基礎,兼有活血、理氣、化濕、安神等功效,以原方或加減方治療各證型冠心病效果顯著[10],已有報道五參順脈膠囊可強心、擴冠、抗凝、調整血脂和糾正心律失常等[11-12]。本研究結果亦發(fā)現(xiàn),五參順脈膠囊可降低心肌損傷大鼠血清cTnI、CK-MB濃度及心肌梗死區(qū)比例,提示五參順脈膠囊對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有一定改善作用。

自噬是實現(xiàn)細胞及細胞器分解、代謝、再利用的一種維持細胞代謝平衡的生理現(xiàn)象,缺血/再灌注、缺氧/復氧等條件下,適度自噬可一定程度保護細胞免于壞死和凋亡,而隨著疾病進展,細胞內會產生過度自噬,造成細胞內環(huán)境紊亂,引發(fā)自噬性死亡[13]。有研究報道,靶向調控自噬性死亡可能是治療心肌缺血再灌注損傷的新策略,在心肌缺血再灌注中存在過度自噬現(xiàn)象,減輕自噬作用可緩解疾病[14-15]。本研究結果發(fā)現(xiàn),與假手術組比較,模型組大鼠心肌梗死區(qū)自噬體數(shù)量增加,自噬標志性蛋白LC3-II/LC3-I亦增加,心肌細胞達到過度自噬水平,從而加重疾病進程。而五參順脈膠囊可減少心肌梗死區(qū)自噬水平,降低LC3-II/LC3-I,提示五參順脈膠囊通過減輕自噬對心肌缺血再灌注損傷大鼠起保護作用。

調控自噬的信號通路很多,其中以PI3K/Akt/mTOR通路研究最為廣泛,PI3K/Akt是一種經典抗凋亡通路,該通路激活可導致Akt活化,Akt磷酸化水平與該通路活化程度密切相關。mTOR對吞噬泡形成及成熟起抑制作用,是調控自噬的關鍵蛋白,抑制mTOR表達后可直接抑制自噬[16-17]。多項研究表明,PI3K/Akt/mTOR通路介導的自噬與缺血再灌注引起的心肌損傷嚴重程度密切相關,激活該通路可抑制過度自噬、減輕心肌細胞損傷[18-20]。本研究結果發(fā)現(xiàn),與模型組比較,五參順脈膠囊可增加心 肌 組 織 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平,提示五參順脈膠囊亦可能通過PI3K/Akt/mTOR通路對侵入性損傷大鼠發(fā)揮保護作用。為了進一步驗證五參順脈膠囊是否通過PI3K/Akt介導的自噬通路發(fā)揮保護作用,本研究采用自噬抑制劑LY294002與五參順脈膠囊共同給藥,結果發(fā)現(xiàn),與五參順脈膠囊組比較,自噬抑制劑組大鼠血清cTnI、CK-MB濃度、心肌梗死區(qū)比例、凋亡指數(shù)、凋亡蛋白caspase3、Bax、自噬體數(shù)量及LC3-II/LC3-I均增加,抗凋亡蛋白Bcl2水平降低,提示五參順脈膠囊抑制心肌細胞過度自噬,發(fā)揮抗心肌梗死、心肌細胞凋亡作用,從而改善缺血再灌注損傷。

綜上所述,五參順脈膠囊抑制心肌細胞過度自噬,對心肌缺血再灌注損傷大鼠發(fā)揮保護作用。本研究進一步豐富與完善了五參順脈膠囊減輕心肌缺血再灌注損傷的作用機制,對其臨床應用具有進一步參考價值。