卞艷麗,張春瑞*,宋書波,張?bào)w鵬

(1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué),鄭州 450000;2.河南省人民醫(yī)院心血管外科,鄭州 450000)

結(jié)直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,是發(fā)達(dá)國家與腫瘤相關(guān)死亡的第二大常見原因。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2018年全球結(jié)直腸癌病例180萬例,約有88萬例結(jié)直腸癌死亡病例,已成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題[1]。盡管結(jié)直腸癌在診斷和治療方面取得了顯著的進(jìn)步,但是患者的存活率仍然較差[2]。結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素及復(fù)雜的過程,與其它類型腫瘤一樣,幾種關(guān)鍵信號(hào)通路中的驅(qū)動(dòng)程序突變會(huì)促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[3]。異常糖基化被視為腫瘤的標(biāo)志,涉及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)和腫瘤增殖、侵襲等過程[4]。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8(fucosyltransferase 8,FUT8)催化α-1,6-鍵的巖藻糖轉(zhuǎn)移到最內(nèi)層N-乙酰氨基葡糖中,完成核心巖藻糖基化[5]。FUT8異常表達(dá)促進(jìn)乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和肝細(xì)胞肝癌等惡性腫瘤的增殖、侵襲和耐藥等腫瘤的惡性生物學(xué)特性[6-8]。Noda等[9]研究報(bào)道FUT8蛋白的表達(dá)可能成為II期和III期結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。但是FUT8在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的具體作用未知,因此本文研究了FUT8對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及作用機(jī)制,旨在獲得FUT8作為結(jié)直腸癌新型治療靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

L15細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶購自美國Hyclone公司;FUT8 siRNA購自上海生工生物技術(shù)有限公司;脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen試劑公司;蛋白裂解液購自北京索萊寶試劑公司;BCA檢測(cè)試劑盒購自美國Thermo公司;5×蛋白上樣緩沖液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天科技有限公司;PVDF膜購自邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司;CCK8試劑購自日本同仁化工試劑有限公司;Boyden小室購自美國BD公司;FUT8、AKT、pAKT和β-catenin抗體購自美國proteintech公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析(GEPIA)數(shù)據(jù)庫分析結(jié)直腸癌組織中FUT8的表達(dá)水平

于GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)中“表達(dá)”菜單中輸入FUT8基因,選擇結(jié)直腸癌進(jìn)行分析。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

SW480細(xì)胞從液氮復(fù)蘇后重懸至含有10%胎牛血清的L15細(xì)胞培養(yǎng)基中,放置在37℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SW480細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長時(shí),采用胰酶收集細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),接種至6孔板中,每孔1×105個(gè)細(xì)胞,分為si-NC組和si-FUT8組。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,將脂質(zhì)體2000與NC siRNA混合后轉(zhuǎn)染至si-NC組細(xì)胞中,脂質(zhì)體2000與FUT8 siRNA混合后轉(zhuǎn)染至si-FUT8組細(xì)胞中。8 h后更換新鮮培養(yǎng)基,放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

胰酶消化收集細(xì)胞,PBS洗3次,加入適量蛋白裂解液吹打細(xì)胞。超聲裂解細(xì)胞30 min,4℃、14000 r/min離心30 min,棄掉細(xì)胞沉淀,吸取液體移至新的EP管中。按照BCA試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞蛋白濃度,并加入5×蛋白上樣緩沖液混勻后沸水煮5 min。SDS-PAGE凝膠電泳80 V電泳120 min,100 V濕轉(zhuǎn)100 min。5%BSA常溫孵育PVDF膜1 h,目的一抗稀釋液(FUT8、AKT、pAKT和β-catenin抗體稀釋比均為1∶500)4℃孵育過夜。TBST洗3次,兔二抗稀釋液(1∶10000)室溫孵育1 h,TBST洗3次后,加ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光。

1.3.4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

在待測(cè)樣品96孔中加入10μL CCK8試劑,培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h。酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測(cè)每個(gè)樣品孔的吸光度值(OD值)。

1.3.5 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲

胰酶消化收集待測(cè)細(xì)胞,無血清培養(yǎng)基將胰酶和血清洗去后進(jìn)行計(jì)數(shù),接種至Boyden小室的上室中,每孔1×105個(gè)細(xì)胞。將Boyden小室放入含有10%胎牛血清的500μL細(xì)胞培養(yǎng)基的24孔板中,作為Boyden小室的下室,放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)16 h左右,細(xì)胞由上室穿入下室時(shí),終止培養(yǎng)。將Boyden小室上未穿過的細(xì)胞采用PBS洗去,甲醇固定,結(jié)晶紫染色。顯微鏡下拍照,計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

1.3.6 SC79處理回復(fù)實(shí)驗(yàn)

SW480細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長時(shí),采用胰酶收集細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),接種至6孔板中,每孔1×105個(gè)細(xì)胞,分為si-NC組、si-FUT8組、si-NC+SC79組和si-FUT8+SC79組。si-NC組和si-FUT8組分別轉(zhuǎn)染NC siRNA和FUT8 siRNA,si-NC+SC79組和si-FUT8+SC79組分別轉(zhuǎn)染NC siRNA和FUT8 siRNA的同時(shí)加入SC79試劑,處理48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較。兩組以上的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用方差分析比較,兩兩間的比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 FUT8在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平

采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析FUT8在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示FUT8 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于其在正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)水平,P＜0.05,見圖1。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析FUT8在結(jié)直腸癌中的表達(dá)Note.Compared with normal colorectal tissues,*P＜0.05.Figure 1 TCGA database analyzed the expression of FUT8 in colorectal cancer

2.2 FUT8 siRNA敲減效果

結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480感染FUT8 siRNA,采用Western blot檢測(cè)FUT8 siRNA干擾效果,結(jié)果顯示si-NC組SW480細(xì)胞中FUT8的相對(duì)表達(dá)量為(0.35±0.05),si-FUT8組SW480細(xì)胞中FUT8相對(duì)表達(dá)量為(0.08±0.02)。si-FUT8組中FUT8相對(duì)表達(dá)量顯著低于si-NC組(t=8.132,P=0.001),見圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)FUT8 siRNA轉(zhuǎn)染效果Note.Compared with si-NC group,*P＜0.05.Figure 2 Western blot detected the transfection effect of FUT8 siRNA

2.3 敲低FUT8對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FUT8對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果顯示與si-NC組SW480細(xì)胞相比,si-FUT8組SW480細(xì)胞增殖能力顯著降低,P＜0.05,見圖3。

圖3 CCK8檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖能力Note.Compared with si-NC group,*P＜0.05.Figure 3 CCK8 detected the proliferation ability of colorectal cancer cells SW480

2.4 敲低FUT8對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

采用Boyden實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FUT8對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響,結(jié)果顯示si-NC組SW480細(xì)胞中FUT8的相對(duì)表達(dá)量為(52.67±4.72),si-FUT8組SW480細(xì)胞中FUT8相對(duì)表達(dá)量為(25.00±4.58),與si-NC組SW480細(xì)胞相比,si-FUT8組SW480細(xì)胞侵襲能力顯著降低(t=7.280,P=0.002),見圖4。

圖4 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480侵襲能力Note.Compared with si-NC group,*P＜0.05.Figure 4 Boyden experiment detected the metastasis of colorectal cancer cells SW480

2.5 SC79對(duì)轉(zhuǎn)染FUT8 siRNA的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SC79對(duì)轉(zhuǎn)染FUT8 siRNA的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果顯示si-NC組和si-NC+SC79組SW480細(xì)胞增殖能力無差異,與si-NC組和si-NC+SC79組相比,si-FUT8組和si-FUT8組+SC79組細(xì)胞增殖能力降低,但是與si-FUT8組相比,si-NC+SC79組細(xì)胞增殖能力增加。P＜0.05,見圖5。

圖5 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SC79對(duì)轉(zhuǎn)染FUT8 siRNA的結(jié)直腸癌細(xì)胞能力的影響Note.Compared with si-NC+SC79 group,*P＜0.05.Compared with si-FUT 8 group,#P＜0.05.The same as below.Figure 5 CCK8 experiment detected the effect of SC79 on the ability of colorectal cancer cells transfectedwith siRNA of FUT8

2.6 SC79對(duì)轉(zhuǎn)染FUT8 siRNA的結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

采用Boyden實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SC79對(duì)轉(zhuǎn)染FUT8 siRNA的結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響,結(jié)果顯示si-NC組、si-NC+SC79組、si-FUT8組和si-FUT8組+SC79組SW480細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為(56.67±7.09)個(gè)、(25.33±1.53)個(gè)、(59.00±3.61)個(gè)和(33.33±3.79)個(gè)。si-NC組和si-NC+SC79組SW480細(xì)胞侵襲能力無差異,與si-NC組和si-NC+SC79組相比,si-FUT8組和si-FUT8組+SC79組細(xì)胞侵襲能力降低,但是與si-FUT8組相比,si-NC+SC79組細(xì)胞侵襲能力增加。P＜0.05,見圖6。

圖6 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SC79對(duì)轉(zhuǎn)染FUT8 siRNA的結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 6 Boyden experiment detected the effect of SC79 on the invasion ability of colorectal cancer cells transfected with FUT8 siRNA

2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FUT8對(duì)AKT/βcatenin信號(hào)通路的影響

采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FUT8對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞AKT/β-catenin信號(hào)通路的影響,結(jié)果顯示si-NC組和si-NC+SC79組SW480細(xì)胞中pAKT和β-catenin蛋白的表達(dá)無顯著性差異,與si-NC組和si-NC+SC79組相比,si-FUT8組和si-FUT8組+SC79組細(xì)胞中pAKT和β-catenin蛋白的表達(dá)降低,但是與si-FUT8組相比,si-NC+SC79組細(xì)胞中pAKT和β-catenin蛋白的表達(dá)增加。P＜0.05,見圖7。

圖7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FUT8對(duì)AKT/β-catenin信號(hào)通路的影響Figure 7 Western blot experiment detected the effect of FUT8 on AKT/β-catenin signaling pathway

3 討論

結(jié)直腸癌是男性和女性中常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著人類的健康[10]。隨著結(jié)腸鏡檢查的普及,結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在過去的幾十年中雖然有所下降,但是由于初次診斷時(shí)患者已處于晚期,手術(shù)切除、化學(xué)治療、放射治療和分子靶向等治療對(duì)其療效有限,導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者的預(yù)后仍然很差[11]。結(jié)直腸是由癌基因、抑癌基因和與DNA修復(fù)機(jī)制相關(guān)的基因突變引起的[3]。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的頻率高是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因[12-13]。因此研究結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制對(duì)探索治療結(jié)直腸癌新的分子靶點(diǎn)非常重要。

糖基化是寡糖鏈與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)共價(jià)連接的過程,其在包括細(xì)胞生長、分化和轉(zhuǎn)化等許多生理和病理變化中發(fā)揮重要作用[4]。巖藻糖基化是腫瘤中最重要的糖基化類型之一,與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。巖藻糖基化是由FUTs家族將巖藻糖轉(zhuǎn)移到糖蛋白和糖脂中合成的,FUTs表達(dá)失調(diào)引起巖藻糖基異?；婕澳[瘤發(fā)生的各種基本細(xì)胞生物學(xué)過程[14]。FUTs家族包括13種成員,其中由FUT8編碼的α1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是唯一負(fù)責(zé)核心巖藻糖基化的酶,而核心巖藻糖基化對(duì)粘附分子和生長因子受體具有重要的調(diào)節(jié)功能,因此FUT8密切參與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和侵襲過程[15]。同時(shí)研究報(bào)道FUT8與實(shí)體腫瘤患者的預(yù)后相關(guān),胰腺導(dǎo)管癌組織中高表達(dá)的FUT8蛋白與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無復(fù)發(fā)生存率顯著相關(guān)[16]。在結(jié)直腸癌組織中FUT8的表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響與p53的狀態(tài)有關(guān),在p53陰性的晚期結(jié)直腸癌患者中FUT8蛋白的陽性表達(dá)與患者更好的無疾病進(jìn)展生存期顯著相關(guān)[9]。但是FUT8在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的功能仍然未知。本文采用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數(shù)據(jù)庫分析顯示FUT8在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于其在正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)水平,提示FUT8在結(jié)直腸癌中發(fā)揮癌基因的作用,與FUT8在其它腫瘤中的表達(dá)情況具有一致性[6-8]。

本文采用siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞抑制FUT8的表達(dá)后,CCK8和Boyden實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,結(jié)果顯示干擾FUT8的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,表明FUT8在結(jié)直腸癌中高表達(dá)促進(jìn)其增殖和侵襲。Tu等[6]報(bào)道抑制FUT8的表達(dá)則抑制了高侵襲性乳腺癌細(xì)胞的侵襲性。癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中FUT8的表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和侵襲能力[17]。與本文中觀察到FUT8的生物學(xué)功能一致。在乳腺癌中FUT8可能通過巖藻糖基化TGF-β受體復(fù)合物,以促進(jìn)TGF-β結(jié)合并增強(qiáng)下游信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮促癌作用[6]。AKT、WNT和KRAS等信號(hào)途徑的改變導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移增加[18-19]。而在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)上調(diào)的FUT8通過激活PI3K-AKT-NFκB信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的增殖能力[8]。FUT8缺乏可以通過減少核β-catenin蛋白的積累抑制乳腺癌細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲[20]。FUT8是否可以調(diào)控AKT/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展,本文采用一種可以增加AKT磷酸化水平的小分子化合物SC79處理FUT8 siRNA轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞,功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SC79和FUT8 siRNA共同作用對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響,結(jié)果顯示si-NC組與si-NC和SC79共同處理組細(xì)胞的增殖和侵襲能力無差異,表明在si-NC組細(xì)胞中AKT信號(hào)通路均為激活狀態(tài)。而與si-NC組相比,si-FUT8和SC79處理組細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低,但是高于si-FUT8組細(xì)胞的增殖和侵襲能力,表明在si-FUT8組細(xì)胞中AKT信號(hào)通路活性被抑制,且SC79僅能部分恢復(fù)AKT信號(hào)通路的活性。同時(shí)Western blot同樣發(fā)現(xiàn)SC79可以減弱FUT8 siRNA對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中pAKT和β-catenin蛋白的抑制作用,表明FUT8通過調(diào)控AKT/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。

綜上所述,FUT8 siRNA可能通過調(diào)控AKT/βcatenin信號(hào)通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,是結(jié)直腸癌候選癌基因,可能是治療結(jié)直腸癌新的分子靶點(diǎn)。