孔慶寅，陳 偉

(上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應綜合征，是目前重癥監(jiān)護室患者死亡的主要原因之一，其發(fā)病機制復雜且尚未闡明，針對膿毒癥救治策略的研究仍未取得根本性突破[1-2]。目前研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥發(fā)病過程中存在炎癥反應亢進和免疫抑制，在發(fā)病早期即出現(xiàn)免疫功能損害，免疫炎癥反應紊亂可能是其發(fā)生、發(fā)展的主要機制[3-4]，因此改善免疫功能可能是防治膿毒癥病程進展的關鍵。本課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，化瘀方可能通過抑制TLR4介導的炎癥反應而改善膿毒癥大鼠的心肌損傷[5]。脾臟作為人體最大的免疫器官，含有大量的B、T淋巴細胞，在膿毒癥患者免疫應答中發(fā)揮著關鍵作用，因此本實驗在前期研究基礎上進一步探究了化瘀方對膿毒癥大鼠脾臟的影響及其作用機制，旨在為膿毒癥的免疫治療提供新的思路與方法。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 6～8周齡健康SPF級雄性Wistar大鼠50只，體重(200±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2017-0005，合格證號：20170005002968。于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心一樓分籠飼養(yǎng)，喂養(yǎng)標準飼料，自由攝取食物和水，室溫(20±2)℃，相對濕度40%～80%，通風潔凈，適應性喂養(yǎng)1周后選取活動正常者納入本次實驗安排。

1.2藥物、試劑與儀器 化瘀方由丹參30 g、大黃15 g組成，飲片為上?？禈蛑兴庯嬈旧a，購自上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房。脂多糖(LPS)購自德國Sigma公司，貨號：T300RS；RT reagent Kit、TB Green qPCR試劑盒購于日本TAKARA公司，貨號分別為RR047A和RR420A；ELISA試劑盒購于碧云天，貨號：Sde15797；AmnioMAXTM- II Complete Medium培養(yǎng)基購于Gibco公司，貨號：11269-016；CD4-Cy7、CD8-PE抗體購于上海司鼎公司，貨號分別為SD0037和SD0045。高通量組織研磨器購自寧波新芝公司；組織研磨儀購自上海凈信科技公司；離心機購自上海安亭科學儀器廠；數字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海躍進醫(yī)療器械廠；臺式高速離心機購自德國Eppendorf公司；qPCR儀購自瑞士Roche公司；電熱恒溫箱購自上海一恒科學儀器公司；PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能公司；金屬浴、渦旋混合器購自中國Kylin-Bell公司。

1.3分組、預處理及造模 50只Wistar雄性大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用完全隨機的方式分為空白組、模型組、化瘀方低劑量組、化瘀方中劑量組、化瘀方高劑量組，每組10只。空白組、模型組給予生理鹽水2 mL灌胃，化瘀方低、中、高劑量組分別給予0.25 g/mL、0.5 g/mL、1 g/mL化瘀方2 mL灌胃，均1次/d，連續(xù)7 d。第8天，空白組大鼠尾靜脈注射生理鹽水6 mL/kg，其余組參考文獻[6]方法于尾靜脈注射LPS 6 mL/kg進行膿毒癥造模。

1.4標本采集與檢測

1.4.1血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平檢測造模6 h后，抽取各組大鼠腹主動脈血漿約10 mL，靜置30 min，離心15 min得血清樣本，按照雙夾心法 ELISA試劑盒使用說明測定血清中TNF-α水平。

1.4.2脾臟病理學觀察 將大鼠處死后迅速取出脾臟，放入4%多聚甲醛中進行固定，制備病理切片進行HE染色，顯微鏡下觀察其病理改變。

1.4.3脾臟組織中T細胞檢測 研磨脾臟，制備脾臟細胞懸液，加入CD4-Cy7和CD8-PE抗體，流式細胞儀上機檢測CD4+T、CD8+T比例，計算CD4+T/CD8+T比值。

1.4.4脾臟組織中TLR4 mRNA表達檢測 取新鮮脾臟組織100 mg研磨成粉狀，加入1 mL Trizol試劑，振蕩混勻，裂解10 min，12 000 r/min(離心半徑9.5 cm)離心10 min取上清，加入后氯仿，振搖15 s，室溫靜置10 min，12 000 r/min(離心半徑9.5 cm)離心15 min，管底可見微量白色沉淀即為總RNA，完全溶解RNA后，紫外分析測定所抽提RNA的濃度。除去RNA中的基因組DNA，在冰上進行反轉錄反應，在冰上配制PCR反應液20 μL。GAPDH-rat上游序列：TTCAACGGCACAGTCAAGG，下游引物序列：CTCAGCACCAGCATCACC；TLR4-rat上游引物序列：TGGTGGCTGTGGAGACAAAA，下游引物序列：AGGCTTGGGCTTGAATGGAG。RT-PCR反應：變性95 ℃ 30 s，1個循環(huán)。定量分析：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；40循環(huán)分析模式：融解曲線95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，1個循環(huán)。降溫：50 ℃ 30 s，1個循環(huán)。反應結束后確認RT-PCR的擴增曲線和溶解曲線，并進行數據分析。采用QuantStudioTMReal-Time PCR Software(AppliedBiosystems)進行數據分析，使用溶解度曲線評估PCR引物的可靠性，用2-ΔΔCT法計算目的基因相對于內參基因beta actin的倍數來表示基因的相對表達量。

2 結 果

2.1各組大鼠脾臟組織病理學表現(xiàn) 空白組大鼠脾臟結構完整正常，胞核飽滿，細胞排列整齊，無炎癥因子浸潤，無充血水腫；模型組大鼠淋巴竇擴張，背膜增厚，炎癥細胞浸潤明顯，網狀細胞增多，脾小結增大，部分胞核溢出破裂；化瘀方各組脾臟淋巴竇輕度擴張，背膜增厚，炎癥細胞浸潤現(xiàn)象較模型組明顯減輕，脾小結增大，偶見胞核溢出破裂現(xiàn)象，化瘀方高劑量組損傷最輕。見圖1。

圖1 空白組和膿毒癥各組大鼠脾臟組織病理學HE染色表現(xiàn)(×200)

2.2各組大鼠血清TNF-α水平比較 空白組、模型組、化瘀方低劑量組、化瘀方中劑量組、化瘀方高劑量組血清TNF-α水平分別為(33.93±3.71)pg/mL、(145.40±5.10)pg/mL、(105.97±10.67)pg/mL、(85.05±8.48)pg/mL、(61.74±6.38)pg/mL，模型組明顯高于空白組，化瘀方各組均明顯低于模型組，且化瘀方中、高劑量組明顯低于化瘀方低劑量組，化瘀方高劑量組明顯低于化瘀方中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.3各組大鼠脾臟組織中CD4+T、CD8+T比例及CD4+T/CD8+T比值比較 與空白組比較，模型組大鼠脾臟組織中CD4+T和CD4+T/CD8+T比值明顯降低(P均<0.05)，CD8+T明顯增高(P均<0.05)?；龇礁鹘M大鼠脾臟組織中CD4+T和CD4+T/CD8+T比值均明顯高于模型組(P均<0.05)，且高劑量組明顯高于中、低劑量組(P均<0.05)，中劑量組明顯高于低劑量組(P均<0.05)；CD8+T均明顯低于模型組(P均<0.05)，且高劑量組明顯低于中、低劑量組(P均<0.05)，中劑量組明顯低于低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠脾臟組織中CD4+T、CD8+T比例及CD4+T/CD8+T比值比較

2.4各組大鼠脾臟組織中TLR4 mRNA表達量比較 空白組、模型組、化瘀方低劑量組、化瘀方中劑量組、化瘀方高劑量組大鼠脾臟組織中TLR4 mRNA表達量分別為0.098±0.029，0.705±0.078，0.280±0.037，0.145±0.062，0.120±0.056，模型組明顯高于空白組，化瘀方各組均明顯低于模型組，且化瘀方中、高劑量組明顯低于化瘀方低劑量組，化瘀方高劑量組明顯低于化瘀方中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

3 討 論

膿毒癥發(fā)病機制相當復雜，涉及體內多個系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)差異大，目前針對膿毒癥治療策略的研究仍未取得根本性進展[6]。膿毒癥的重要致病因子內毒素主要由細菌繁殖或壞死過程中產生，其主要化學成分LPS是革蘭陰性桿菌細胞壁的重要組成成分，它可以激活單核細胞和巨噬細胞，并引起多種炎癥介質如TNF-α、IL-1、IL-6等的釋放，隨即出現(xiàn)炎癥反應失控并持續(xù)放大，伴隨著自我破壞，最終形成瀑布效應，表現(xiàn)為炎癥細胞活化迅速擴散和炎癥介質的泛濫[7-9]。一般認為，膿毒癥由炎癥反應開始，若炎癥未得到控制，可能導致機體免疫抑制甚至免疫麻痹[10]。早期膿毒癥死亡的通常原因系促炎癥反應導致細胞因子風暴，使組織器官細胞凋亡，而脾臟細胞凋亡最嚴重，其猛烈程度與脾臟淋巴細胞凋亡相契合。而淋巴細胞中又以B細胞和CD4+T細胞凋亡最嚴重，CD8+T細胞反而升高。淋巴細胞的大量凋亡，特別是CD4+T細胞凋亡促進了抑制細胞因子釋放增加、T淋巴細胞克隆無反應性[11-12]。淋巴細胞大量減少，免疫穩(wěn)態(tài)被打破，機體就會出現(xiàn)遲發(fā)性超敏反應喪失、清除病原能力減退、繼發(fā)性感染易發(fā)等免疫抑制表現(xiàn)，免疫細胞凋亡與免疫無反應性又促進膿毒癥的發(fā)生[13]。在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中，TLR4信號通路扮演著重要角色。膿毒癥發(fā)生時，TLR4受體通過識別LPS檢測革蘭陰性桿菌，LPS作為革蘭陰性細菌細胞壁的重要組成成分，也是TLR4的主要配體。LPS首先與LBP相結合，然后與細胞表面的CD14分子相結合，共同活化TLR4信號傳導途徑，從而活化NF-κB，并進一步誘導多種促炎細胞因子如TNF-α和IL-6的產生[14-15]。TLR4信號通路與膿毒癥炎癥反應密切相關，其信號通路中的相關分子還可以作為膿毒癥治療的靶點，具有良好的生物醫(yī)學應用前景。

中國古代醫(yī)籍中并無“膿毒癥”概念，但許多古籍如《黃帝內經》《傷寒論》及《溫熱論》等可見大量類似膿毒癥的描述，可歸屬于“傷寒”“溫病”的范疇，均屬正虛邪實，熱毒內盛、痰血瘀滯、氣陰兩虛等為膿毒血癥的基本病機[16-17]。“毒”為膿毒癥感染之源，“毒”之無形無處不在，如六淫之邪、時疫之氣。毒邪外感，人體之正氣耗損，傷及臟腑而生內毒[18]。熱毒熾盛則耗傷氣陰，瘀毒阻隔經絡終致氣陰虧虛及氣滯血瘀[19]。瘀滯絡脈是膿毒癥的重要部位，《類經》中說：“深而在內者為陰絡……淺而在外者為陽絡?！闭摱笆ⅲ拘坝杀頊\之陽絡深入陰絡，病邪盤踞臟腑之絡，疾病遷延難愈，臟腑功能難以恢復[20-21]。膿毒癥的治療需“扶正”與“祛邪”雙管齊下，單純性對抗性治療只能完成“祛邪”的任務，而完善對靶器官的保護性治療才能解決“扶正”的問題[22]，故殺菌、解毒、扶正、化瘀為膿毒癥的核心治療理念。化瘀方為通腑化瘀清熱解毒之大黃聯(lián)合活血化瘀之丹參組成，大黃具有通便瀉熱、清熱解毒、消癰散腫、破血行瘀等功效；丹參可以活血、涼血、清心，丹參提取物具有一定的抑菌作用。臨床應用化瘀方治療膿毒癥可有效改善臨床癥狀，減輕炎癥反應。

本實驗通過尾靜脈注射LPS進行膿毒癥造模，可以導致促炎細胞因子的劇烈釋放，真實表現(xiàn)膿毒癥急性感染狀態(tài)。尾靜脈注射LPS 6 h后，脾臟組織HE染色切片顯示模型組大鼠淋巴竇擴張，背膜增厚，炎癥細胞浸潤明顯，網狀細胞增多，脾小結增大，部分胞核溢出破裂，化瘀方各組中脾臟也有不同程度炎癥細胞浸潤，但化瘀方高劑量組脾臟損傷最輕，結果證明大鼠尾靜脈注射LPS建立膿毒癥模型成功并對脾臟組織造成損傷，化瘀方一定程度上可減輕膿毒癥大鼠脾臟損傷。各組大鼠血清TNF-α水平檢測顯示，膿毒癥過程中TNF-α表達明顯增加，造成過度炎癥反應；化瘀方可以抑制TNF-α釋放，從而減輕炎性損傷。T淋巴細胞和TLR4 mRNA表達檢測顯示，模型組大鼠脾臟組織中CD4+T和CD4+T/CD8+T比值明顯降低，CD8+T和TLR4 mRNA表達量明顯增高；化瘀方各組大鼠脾臟組織中CD4+T和CD4+T/CD8+T比值均明顯高于模型組，CD8+T和TLR4 mRNA表達量均明顯低于模型組，且高劑量組變化更明顯。表明化瘀方可以抑制膿毒癥所致T淋巴細胞凋亡，下調大鼠脾臟組織TLR4 mRNA的表達。

綜上所述，化瘀方可以減輕膿毒癥大鼠脾臟損傷，其機制可能與抑制膿毒癥所致T淋巴細胞凋亡，提高機體免疫力，調控TLR4信號通路，抑制炎癥因子的產生有關。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。