陳浩雄，徐啟良，黃競(jìng)杰，林新珍，徐寧達(dá)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(福田)，廣東 深圳 518034)

膝骨關(guān)節(jié)炎是骨科臨床很常見(jiàn)的退行性、進(jìn)展性疾病，病理改變以關(guān)節(jié)軟骨退變、皺縮、潰瘍?yōu)樘卣?。軟骨?xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)組成關(guān)節(jié)軟骨，生物學(xué)因素或力學(xué)因素可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞合成和凋亡平衡的破壞，造成軟骨細(xì)胞減少和軟骨基質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎發(fā)生[1]。 目前研究認(rèn)為多種細(xì)胞因子參與關(guān)節(jié)軟骨的合成與分解，其中白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌失常與關(guān)節(jié)軟骨的破壞及修復(fù)密切相關(guān)，因此抑制炎癥因子的異常表達(dá)顯得尤為重要。目前臨床中所使用的治療關(guān)節(jié)炎的藥物主要為非甾體消炎止痛藥減緩控制炎癥的進(jìn)展，氨基葡萄糖、玻璃酸鈉等營(yíng)養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨，結(jié)合非藥物療法如肌力鍛煉、控制體重、局部理療等減緩關(guān)節(jié)軟骨損傷、退變，但尚不能根治。膝骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“膝痹病”，從中醫(yī)辨證多為肝腎不足、氣滯血瘀，治療以補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、活血通絡(luò)為法。前期研究證實(shí)，牛膝提取物能促進(jìn)兔骨關(guān)節(jié)炎模型骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，且牛膝總皂苷含藥血清體外能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖[2-3]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了不同濃度牛膝總皂苷對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖及凋亡和炎性因子IL-1、TNF-α表達(dá)的影響，以探討單味中藥體外干預(yù)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1試劑與儀器 DMEM：F12(1∶1)培養(yǎng)基(Gibco)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)；流式細(xì)胞儀(BD)；DAPI染液(碧云天生物研究所)；抗熒光衰減封片劑(碧云天生物研究所)；倒置熒光顯微鏡(DM16000B，Leica)；胎牛血清(FBS)(Gibco)；10%甲醛標(biāo)本固定液；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；CCK-8試劑盒(CK04，東仁化學(xué))；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(Gibco)；Collagen Ⅱ抗體(abcam)；牛膝總皂苷(深圳市中醫(yī)院藥劑科制備)；甲苯胺藍(lán)染色液Annexinv-pe/7-AAD流式凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物),流式細(xì)胞生物儀(BD)，離心機(jī)(Thermo Fisher公司)。

1.2關(guān)節(jié)軟骨取樣 取3例女性晚期膝骨關(guān)節(jié)炎行膝關(guān)節(jié)置換患者的膝軟骨細(xì)胞組織，征得參與研究的患者知情同意。

1.3方法

1.3.1人軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng) 將獲取的軟骨組織先用PBS(含雙抗)漂洗3次，用顯微手術(shù)剪將附著軟骨塊的軟組織剪除，剪碎軟骨塊面積約1 mm3。用DMEM/F-12完全培養(yǎng)基(含10% FBS、及1%雙抗)，在溫度37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞。每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞1次，每2～3 d換液1次。培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長(zhǎng)到80%左右時(shí)，消化收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，1 000 r/min離心4 min，棄上清液，以1∶3比例轉(zhuǎn)移培養(yǎng)。

1.3.2不同濃度牛膝總皂苷培養(yǎng)基的制備 10 mg/mL牛膝總皂苷儲(chǔ)存液：稱取10 mg牛膝總皂苷，加入1 mL D/F12完全培養(yǎng)基溶解，過(guò)濾除菌后于-20 ℃保存。1 mg/mL 牛膝總皂苷D/F12培養(yǎng)基配制：取一無(wú)菌EP管，加入0.9 mL D/F12完全培養(yǎng)，再加入0.1 mL含10 mg/mL牛膝總皂苷儲(chǔ)存液，混勻，即可；按相同方法比例，再分別制備0.5 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.01 mg/mL牛膝總皂苷D/F12培養(yǎng)基。

1.3.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 實(shí)驗(yàn)分為空白組、牛膝總皂苷0.01 mg/mL組、牛膝總皂苷0.05 mg/mL組、牛膝總皂苷0.1 mg/mL組、牛膝總皂苷0.5 mg/mL組、牛膝總皂苷1 mg/mL組。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用D/F12完全培養(yǎng)基使軟骨細(xì)胞懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度1×105個(gè)/mL，于96孔板中接種，各孔加0.1 mL細(xì)胞懸液，在37 ℃，5% CO2條件下孵育過(guò)夜。牛膝總皂苷各組給予相應(yīng)濃度牛膝總皂苷干預(yù)，于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定培養(yǎng)1，3，5，7 d后OD值，繪制軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

圖1 各組膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)增殖情況

1.3.4Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 按照1.3.3方法分組干預(yù)3 d后，依次添加PI染液、Binding Buffer、Annexin V-FITC搖勻，室溫，避光反應(yīng)5～15 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm，Annexin V-FITC熒光信號(hào)呈綠色，使用FL1通道檢測(cè)；激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em≥630 nm，PI紅色熒光用FL3通道檢測(cè)。

1.3.5IL-1β、TNF-α檢測(cè) 按照1.3.3方法分組干預(yù)72 h, 應(yīng)用放射免疫分析法檢測(cè)IL-1β水平,應(yīng)用ELISA法檢測(cè)TNF-α水平，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每份標(biāo)本至少測(cè)定3次, 取平均值。

2 結(jié) 果

2.1各組膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖情況 各組細(xì)胞培養(yǎng)第1～3天為對(duì)數(shù)增殖期；牛膝總皂苷各組第3天達(dá)到高峰(空白組第5天達(dá)到高峰)，第3～5天進(jìn)入平臺(tái)期，之后呈下降趨勢(shì)，牛膝總皂苷0.5 mg/mL組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖OD值均明顯高于其他組(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2各組膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡情況 培養(yǎng)3 d后，牛膝總皂苷0.01 mg/mL和0.05 mg/mL組早期細(xì)胞凋亡率、晚期細(xì)胞凋亡率、總凋亡率與空白組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；牛膝總皂苷0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL組早期細(xì)胞凋亡率、晚期細(xì)胞凋亡率、總凋亡率均明顯低于空白組(P均<0.05)，牛膝總皂苷0.5 mg/mL組細(xì)胞總凋亡率明顯低于牛膝總皂苷0.1 mg/mL和1 mg/mL組(P均<0.05)。 見(jiàn)圖2及表1。

空白組

牛膝總皂苷0.01 mg/mL組

牛膝總皂苷0.1 mg/mL組

牛膝總皂苷0.5 mg/mL組

牛膝總皂苷0.05 mg/mL組

牛膝總皂苷1 mg/mL組

表1 各組干預(yù)3 d后人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡率比較

2.3各組膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平 干預(yù)72 h，牛膝總皂苷各組IL-1β、TNF-α水平均明顯低于空白組(P均<0.05)，且牛膝總皂苷濃度越高，IL-1β、TNF-α水平越低，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α水平比較

3 討 論

膝骨關(guān)節(jié)炎是慢性炎性進(jìn)展性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前研究認(rèn)為IL-1、TNF-α是引起關(guān)節(jié)炎炎性變及軟骨基質(zhì)破壞的重要細(xì)胞因子，特別是IL-1能抑制軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖和Ⅱ型膠原，為降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要炎性介質(zhì)[4]，其能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)合成，同時(shí)通過(guò)胞漿素原激活物的分泌，促進(jìn)MMPs活化，并抑制胞漿素原激活物抑制物的合成，導(dǎo)致軟骨的破壞[5]。Osta等[6]研究認(rèn)為TNF-α和IL-1β具有抑制軟骨合成、加快關(guān)節(jié)軟骨降解的作用，在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中起到重要介導(dǎo)作用。

目前膝骨關(guān)節(jié)炎的治療方法有限，其中非甾體消炎止痛藥雖可明顯緩解疼痛，但存在明顯胃腸道反應(yīng)；鹽酸或硫酸氨基葡萄糖起效慢、療程長(zhǎng)，是否能減慢疾病的進(jìn)展尚不明確；玻璃酸鈉對(duì)早、中期患者有一定效果，但其在保護(hù)軟骨和減慢疾病進(jìn)程中的作用不大；糖皮質(zhì)激素短期應(yīng)用可明顯緩解病情，但頻繁使用會(huì)加重關(guān)節(jié)軟骨的損傷及導(dǎo)致全身?yè)p害；膝關(guān)節(jié)置換是終極療法，術(shù)后有并發(fā)癥，多數(shù)患者并不適用[7]。

中醫(yī)治療骨關(guān)節(jié)炎以補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，活血化瘀通絡(luò)止痛為法[8]?！侗静萁?jīng)》中記載牛膝能“主寒濕痿痹，四肢拘攣，膝痛不可屈伸”，是治療膝痹的有效藥物,也是中醫(yī)補(bǔ)腎活血法的代表藥物之一[9-10]。其有效成分有多糖類、皂苷類、甾酮類等[11]，其中皂苷類具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和抗軟骨細(xì)胞凋亡的作用[12-13]。余闐等[14]證實(shí)牛膝總皂苷能減輕兔骨關(guān)節(jié)炎滑膜病變，同時(shí)能明顯降低關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β等炎癥因子含量。廖州偉等[15]和胡烈奎等[16]研究發(fā)現(xiàn)牛膝醇提物、牛膝含藥血清可以明顯促進(jìn)膝關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖及抑制其凋亡。孫雪蓮等[17]研究發(fā)現(xiàn)牛膝總皂苷能夠上調(diào)兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中TGF-β1的表達(dá)而下調(diào)IL-1β的表達(dá)，減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷。以上研究表明牛膝有利于抑制膝骨關(guān)節(jié)炎炎癥的進(jìn)展并對(duì)關(guān)節(jié)軟骨有修復(fù)作用。

本課題組前期研究證實(shí)補(bǔ)腎活血中藥可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路從而降低IL-1和TNF-α水平，減輕患膝關(guān)節(jié)疼痛,改善膝關(guān)節(jié)功能[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.05，0.1，0.5，1.0 mg/mL牛膝總皂苷體外培養(yǎng)人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞能夠明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，增殖高峰出現(xiàn)在干預(yù)后的第3天，最佳濃度為0.5 mg/mL；且隨著牛膝總皂苷濃度增高，細(xì)胞凋亡減少，0.5 mg/mL時(shí)凋亡最少，1.0 mg/mL時(shí)凋亡又增加；IL-1、TNF-α水平隨著牛膝總皂苷濃度的升高而逐漸降低。提示不同濃度的牛膝總皂苷在體外干預(yù)膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和抑制其凋亡，且與濃度有關(guān)。在目前傾向于體外用藥、局部用藥的大環(huán)境下，本次實(shí)驗(yàn)為關(guān)節(jié)腔注藥治療骨關(guān)節(jié)炎提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)及可能性。然而，藥物的干預(yù)與細(xì)胞受體的數(shù)目、信號(hào)通路的類型及軟骨細(xì)胞的生存環(huán)境等有關(guān)，高濃度的牛膝總皂苷很可能會(huì)改變軟骨細(xì)胞的最佳生存環(huán)境，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖與凋亡，這仍需進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。