孫晶晶殷 瑋凌 珊彭佳裕蔡文鎮(zhèn)倪慶純

（廣州醫(yī)藥研究總院有限公司，廣東 廣州510240）

復(fù)方丹參制劑是以丹參、三七為主要成分的復(fù)方制劑，為我國(guó)治療心血管疾病的常用中藥，已有至少30年的應(yīng)用歷史［1?4］，主治氣滯血瘀所致的胸痹，以及胸悶、心前區(qū)刺痛、冠心病心絞痛見(jiàn)上述證候者，對(duì)冠心病、心絞痛、動(dòng)脈粥樣硬化有很好的療效［5?7］，但同時(shí)也伴有胃腸道反應(yīng)、頭痛、出血等不良反應(yīng)［8?10］。方中丹參主要成分包括丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸A～G 等水溶性酚類(lèi)化合物，以及丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等脂溶性二萜類(lèi)化合物；三七主要含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1 等皂苷類(lèi)成分，具有不同的藥理活性［11?18］。

目前，已有對(duì)丹參、三七體內(nèi)血藥濃度分別進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道［19?22］，或?qū)?fù)方丹參制劑中不同成分進(jìn)行血漿前處理［23］、在不同色譜條件下進(jìn)行分離檢測(cè)［24］，但操作復(fù)雜繁瑣。因此，本實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS／MS）法測(cè)定復(fù)方丹參制劑中丹酚酸B、丹參素、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的血藥濃度，該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性高，可用于相關(guān)藥動(dòng)學(xué)研究。

1 材料

1.1 儀器 Sciex Qtrap 5500 質(zhì)譜儀串聯(lián)Shimadzu LC 30AD 液相色譜儀，配置四極桿質(zhì)譜儀配電噴霧離子源（ESI）；Sigma3?18K 高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；氮吹儀（八方世紀(jì)科技有限公司）；旋渦振蕩器；精密移液槍?zhuān)ǖ聡?guó)Eppendorf 公司）。

1.2 試劑與藥物 丹酚酸B、丹參素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均＞98%）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（德國(guó)Merck 公司，純度分別≥99.8%、99.9%、99.8%）；甲酸（阿拉丁控股集團(tuán)有限公司，純度≥98%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 XBridge BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相水（含0.1% 甲酸）（A）?甲醇（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10%～95%B；0.5～2.0 min，95%B；2～2.2 min，95%～10%B；2.2～3.0 min，10% B）；體積流量0.30 mL／min；柱溫40 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度8 ℃；進(jìn)樣量3.00 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正負(fù)離子模式（Positive／Negative）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；氣簾氣（CUR）25 psi（1 psi ＝0.133 kPa）；離子源氣體1（Gas1）50 psi；離子源氣體2（Gas2）50 psi；離子源噴霧電壓（IS）5 500 V；離子源溫度（TEM）550 ℃；分辨率Q1／Q3（Resolution Q1／Q3）Unit／Unit；碰撞氣（CAD）Medium；暫停時(shí)間（MR Pause）20 ms；質(zhì)譜采集時(shí)間3.00 min；去簇電壓120.0 V；入口電壓10.00 V；出口電壓25.00 V；停留時(shí)間100.0 ms。離子對(duì)、碰撞能見(jiàn)表1。

表1 各成分、內(nèi)標(biāo)的離子對(duì)和碰撞能Tab.1 Ion pairs and collision energies of various constituents and internal standard

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 稱(chēng)取丹酚酸B、丹參素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1 對(duì)照品適量，溶于80% 甲醇中，即得（質(zhì)量濃度為1.00 mg／mL）。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液 稱(chēng)取卡馬西平對(duì)照品適量，溶于80%甲醇中，即得（質(zhì)量濃度為1.00 mg／mL）。

2.4 血漿樣本前處理 精密吸取大鼠血漿50 μL，加入內(nèi)標(biāo)（卡馬西平）50 μL（200 ng／mL），渦旋1 min 后充分混勻，再加入600 μL 乙酸乙酯?正己烷（3∶1）混合溶液萃取，渦旋10 min 后4 ℃、5 000 r／min 下離心10 min，取上清液400 μL，室溫下氮?dú)獯蹈?，再加?50 μL 80%甲醇復(fù)溶，渦旋5 min，5 000 r／min 離心5 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取空白血漿、空白血漿＋對(duì)照品（4.00 ng／mL）＋內(nèi)標(biāo)、給藥8 h 后血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，丹酚酸B、丹參素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、內(nèi)標(biāo)（卡馬西平）保留時(shí)間分別為1.56、0.62、1.87、1.92、1.63、1.65、1.74、1.68 min，各成分之間分離度良好，在相應(yīng)離子通道中不受內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

圖1 各成分代表性色譜圖Fig.1 Representative chromatograms of various constituents

2.5.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 用80%甲醇將1.00 mg／mL對(duì)照品溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)玫较鄳?yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液及混合質(zhì)控樣本工作溶液。向380 μL空白血漿中加入上述溶液各20.0 μL，混合均勻，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)血漿樣本及質(zhì)控血漿樣本，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以血漿中各成分質(zhì)量濃度（ng／mL）為橫坐標(biāo)（X），各成分與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表2 各成分線(xiàn)性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.3 提取回收率試驗(yàn) 用低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本配制6個(gè)樣品，同時(shí)提取18個(gè)不含待測(cè)物但含有內(nèi)標(biāo)的對(duì)照樣本（混合基質(zhì)），在提取液中加入各成分并保證與各提取樣本的理論質(zhì)量濃度一致，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算提取回收率，提取回收率＝（C／S）×100%，其中C為質(zhì)控樣本中待測(cè)物峰面積，S為對(duì)照樣本中待測(cè)物峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 取6個(gè)來(lái)源的空白基質(zhì)，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，于空白血漿上清液中加入各成分和內(nèi)標(biāo)，計(jì)算含基質(zhì)、不含基質(zhì)樣品峰面積的比值和基質(zhì)因子，內(nèi)標(biāo)歸一化法分析基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 配置定量下限及低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣本，平行6 份，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分精密度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of precision， extraction recovery and matrix effect tests for various constituents（n＝6）

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 通過(guò)分析質(zhì)控樣品在室溫下保存12 h 來(lái)確定短期穩(wěn)定性，通過(guò)分析質(zhì)控樣品在4 ℃下保存24 h 來(lái)確定自動(dòng)進(jìn)樣器穩(wěn)定性，通過(guò)分析質(zhì)控樣品在－80 ℃下凍融循環(huán)3 次后與新制備的相同質(zhì)量濃度樣品進(jìn)行比較來(lái)確定凍融循環(huán)穩(wěn)定性，通過(guò)分析質(zhì)控樣品在－80 ℃下儲(chǔ)存1個(gè)月后與新制備的相同質(zhì)量濃度樣品進(jìn)行比較來(lái)確定長(zhǎng)期穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各成分穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of stability tests for various constituents

2.5.7 藥動(dòng)學(xué)研究 稱(chēng)取片劑適量，加入0.9%氯化鈉注射液制成混懸液，搖勻待用。6 只大鼠灌胃給予上述混懸液，給藥劑量為4.0 g／kg，于給藥前及給藥后10、20、30、60、120、240、360、480、1 440、2 880 min 眼眶采血各0.3 mL，置于肝素化試管中，2 000×g離心15 min，分離血漿，置于－80 ℃冰箱中保存，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，繪制血藥濃度?時(shí)間曲線(xiàn)，通過(guò)DAS 3.0 軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2、表5。

圖2 各成分血藥濃度?時(shí)間曲線(xiàn)Fig.2 Plasma concentration?time curves for various constituents

表5 各成分主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for various constituents

3 討論

本實(shí)驗(yàn)儀器采用超高壓液相色譜，樣本分析時(shí)間縮短到3 min；質(zhì)譜采用MRM 模式，具有高靈敏度、高選擇性；采用梯度洗脫，可使內(nèi)標(biāo)和待測(cè)物保留時(shí)間接近，并避免基質(zhì)效應(yīng)；流動(dòng)相采用0.1%甲酸作為水相，可提高待測(cè)物的響應(yīng)，甲醇作為有機(jī)相，色譜峰形較好；樣本前處理過(guò)程中曾嘗試采用蛋白沉淀法和液液萃取法，其中前者分別以甲醇、乙腈為沉淀劑，發(fā)現(xiàn)多種成分回收率不夠理想，后者分別以乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、與環(huán)己烷混合的溶劑進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯?正己烷（3∶1）的提取效率最高，最終采用該溶劑進(jìn)行液液萃取，吹干后復(fù)溶進(jìn)樣。

藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，丹參素、人參皂苷Rb1 在大鼠體內(nèi)的Cmax、AUC0～t相對(duì)較高，是主要入血成分；人參皂苷Rb1、丹參酮Ⅰ在大鼠體內(nèi)的消除半衰期、平均滯留時(shí)間較長(zhǎng)，而三七皂苷R1 兩者較短，其余比較接近，與文獻(xiàn)［23?25］報(bào)道接近，揭示了不同成分體內(nèi)維持時(shí)間，可為研究復(fù)方丹參制劑體內(nèi)作用規(guī)律提供依據(jù)。