畢映燕李盛華李喜香劉效栓

（甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730050）

消腫止痛顆粒（甘藥制字Z04000844）為甘肅省名中醫(yī)、隴中正骨流派學(xué)術(shù)帶頭人李盛華主任醫(yī)師集數(shù)十年經(jīng)驗(yàn)而制成，由當(dāng)歸、生地黃、青皮、白芍、澤蘭、紅花、木香、川芎、水蛭、甘草等12 味中藥組成，具有祛風(fēng)除濕、活絡(luò)止痛功效，用于治療肝腎虧虛、筋脈瘀滯型骨痹，而骨性關(guān)節(jié)炎也屬于中醫(yī)“骨痹”范疇［1］。課題組前期采用D?混料設(shè)計(jì)對(duì)消腫止痛顆粒制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了物理指紋圖譜以控制其外在質(zhì)量［2］，但目前其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅以芍藥苷含量為質(zhì)量控制指標(biāo)，不能完全反應(yīng)其內(nèi)在質(zhì)量［3］。

現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，白芍中芍藥苷、當(dāng)歸中阿魏酸、甘草中甘草苷具顯著抗炎活性［4?6］，對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎具有積極保護(hù)作用；青皮中橙皮苷是治療關(guān)節(jié)炎類藥物的質(zhì)量標(biāo)志物［7］；熟地黃中毛蕊花糖苷是其特有抗炎藥效成分，可調(diào)節(jié)骨代謝［8］。因此，本實(shí)驗(yàn)選取芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷作為指標(biāo)成分，建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定其含量，以期為全面控制消腫止痛顆粒質(zhì)量及二次開發(fā)提供參考。

1 材料

Agilent 1206型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；125SM型電子天平（德國Satorius 公司）；HS6150型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。芍藥苷（批號(hào)110736?200629）、阿魏酸（批號(hào)110773?201614，純度99.0%）、毛蕊花糖苷（批號(hào)11530?201713，純 度 92.5%）、甘草苷（111610?201005，純度94.9%）、橙皮苷（110721?201115，純度95.3%）對(duì)照品均購于中國食品藥品檢定研究院。消腫止痛顆粒（20200101，20200102，20200103）由甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心提供。甲醇（色譜純，山東禹王集團(tuán)化工分公司）；甲醇（分析純，天津市博迪化工有限公司）；磷酸（色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠）；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Symmetry Shield?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）?0.1%磷酸（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長230 nm（0～30 min）、330 nm（30～51 min）、230 nm（51～55 min）、280 nm（55～64 min）；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 系統(tǒng)適用性考察 精密吸取芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷混合對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定5 次，測(cè)得5種成分峰面積RSD分別為0.85%、0.95%、0.42%、1.05%、1.1%；理論塔板數(shù)以芍藥苷計(jì)應(yīng)不低于5 000，分離度均大于1.5。

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的對(duì)照品適量，甲醇溶解，制備成每1 mL分別含芍藥苷1.61 mg、阿魏酸0.33 mg、甘草苷2.00 mg、毛蕊花糖苷0.462 mg、橙皮苷1.04 mg 的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液 取顆粒適量，研細(xì)，精密稱取5.0 g，置于50 mL 三角瓶中，加25 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，25 ℃下超聲（300 W、25 kHz）處理45 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液 按照處方工藝，制得缺白芍、當(dāng)歸、地黃、甘草、陳皮的陰性樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分分離度理想，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，甲醇稀釋成每1 mL分別含芍藥苷20.125、40.25、80.5、161、201.25 μg，阿魏酸4.125、8.25、16.5、33、41.25 μg，甘草苷25、50、100、200、250 μg，毛蕊花糖苷 5.775、11.55、23.1、46.2、57.75 μg，橙皮苷13、26、52、104、130 μg 的溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度3 次。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積，測(cè)得芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷日間、日內(nèi)精密度RSD分別為0.75%、1.14%，0.95%、1.02%、1.13%及1.56%，0.88%、0.91%，0.78%、1.23%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，于0、4、8、12、18、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷峰面積RSD分別為1.08%、1.68%、1.26%、1.55%、1.23%，表明溶液 在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒（批號(hào)20200101）6 份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷峰面積 RSD分別為1.36%、1.95%、1.72%、1.93%、1.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的顆粒（批號(hào)20200101）2.5 g，共6 份，按100%水平精密加入對(duì)照品溶液適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.10 樣品含量測(cè)定 取3 批顆粒（批號(hào)20200101、20200101、20200101），按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長確定 本實(shí)驗(yàn)在190～400 nm 波長處對(duì)芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長分別為230、323、334、237、274 nm，最終選擇波長切換方式［9］，可降低雜質(zhì)對(duì)色譜峰的干擾，從而實(shí)現(xiàn)多成分含量的同時(shí)測(cè)定。

3.2 流動(dòng)相、柱溫、色譜柱確定 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈及不同體積分?jǐn)?shù)磷酸、醋酸［10?14］，發(fā)現(xiàn)以甲醇?水（含0.1% 磷酸）為流動(dòng)相時(shí)色譜峰分離度和峰型良好。芍藥苷峰形隨柱溫變化較明顯，高于25 ℃時(shí)色譜峰拖尾明顯，而低于25 ℃時(shí)其對(duì)稱性理想。同時(shí)，考察了Agilent C18、Waters C18等色譜柱，發(fā)現(xiàn)5種成分峰形相近，即兩者均可用于含量測(cè)定［15］。

3.3 提取方法、溶劑及提取時(shí)間確定 本實(shí)驗(yàn)比較了超聲、回流提取，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)5種成分的提取率相差不大，故選擇操作更簡便的前者作為提取方法。再對(duì)提取溶劑進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)以含水甲醇提取時(shí)會(huì)溶解了一定量糊精與糖粉，導(dǎo)致基線噪音較大［15］，不利于5種成分含量測(cè)定，故選擇甲醇。然后，比較了提取時(shí)間15、30、45、60 min，發(fā)現(xiàn)超聲45 min 后提取率最高。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定消腫止痛顆粒中芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、橙皮苷的含量，該方法簡便可行［17］，可用于該制劑質(zhì)量控制，也為其他醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。