常麗靜李明月韋花花陳 新

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)長(zhǎng)白山道地藥材藥效物質(zhì)重點(diǎn)研究室，吉林 長(zhǎng)春130117）

升陷湯是《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中第73 首方劑，源于《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由君藥黃芪、臣藥柴胡及升麻、佐藥知母、使藥桔梗組成，主治胸中大氣下陷，氣短不足以息，或努力呼吸，有似乎喘，或氣息將停，危在頃刻?，F(xiàn)代研究表明，該方對(duì)急性呼吸窘迫綜合征患者療效明顯［1］，加味聯(lián)合硫酸沙丁胺醇治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期的作用明顯優(yōu)于單用硫酸沙丁胺醇，可改善呼吸力學(xué)指標(biāo)、血?dú)夥治鲋笜?biāo)，調(diào)節(jié)血清過(guò)氧化脂質(zhì)水平［2］，不良反應(yīng)少，是一種安全有效的治療策略［3］，但目前缺乏其質(zhì)量評(píng)價(jià)及監(jiān)測(cè)方法，也尚無(wú)關(guān)于其物質(zhì)基準(zhǔn)的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC?ELSD 法建立了升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的特征指紋圖譜，并通過(guò)電導(dǎo)儀、PH 計(jì)對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，可彌補(bǔ)該方成分分析與質(zhì)量控制的空缺，并為其他復(fù)方制劑物質(zhì)基準(zhǔn)的相關(guān)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LXJ?ⅡB 低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HWS12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Centrifuge 5810R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）；DDSJ?308A電導(dǎo)率儀（上海雷磁儀器廠）；實(shí)驗(yàn)室PH 計(jì)［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］。

1.2 試劑與藥物 黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 對(duì)照品（批號(hào)110781?201616、111839?201505、111851?201708，純 度 96.9%、94.5%、96.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher 公司）；水為蒸餾水。

1.3 藥材 黃芪（產(chǎn)地甘肅、河北、內(nèi)蒙古）、柴胡（產(chǎn)地山西、甘肅、陜西）、升麻（產(chǎn)地吉林）、桔梗（產(chǎn)地河北）、知母（產(chǎn)地河北）各15批，均購(gòu)自吉林省安國(guó)藥業(yè)集團(tuán)有限公司、吉林省北藥藥材加工有限公司，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心肖井雷教授鑒定為正品。升陷湯中上述5味飲片均為生用，將其切制成厚片，并予以編號(hào)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)煎液制備 《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》［4］記載，升陷湯原方為“生箭芪六錢(qián)，知母三錢(qián)，柴胡一錢(qián)五分、桔梗一錢(qián)五分、升麻一錢(qián)”，而在清代一兩（37.3 g）為十錢(qián)，一錢(qián)為十分，則一錢(qián)為3.73 g，五分為1.865 g，即方中組方藥材用量分別為黃芪22.4 g、知母11.2 g、柴胡5.6 g、桔梗5.6 g、升麻3.7 g。根據(jù)前期遵古研究升陷湯煎煮工藝，以桑柴火為煎煮用火，結(jié)合醫(yī)家用藥習(xí)慣“知母后下”“煮數(shù)沸”“次煎原不可廢”確定煎煮方法，以煎出量“一大盅”確定加水量，通過(guò)HPLC?DAD 紫外指紋圖譜進(jìn)行電加熱工藝擬合，具體方法為按處方劑量稱取藥味共48.5 g，先將黃芪、升麻、柴胡、桔梗飲片置于分體黑陶壺中，加10 倍量水浸泡30 min，200 ℃電陶爐加熱至沸，沸后8 min 下知母飲片，繼續(xù)煎煮7 min，濾過(guò)，藥渣加8 倍量水，200 ℃電陶爐加熱至沸，沸后繼續(xù)煎煮10 min，濾過(guò)，煎液合并2 次，適當(dāng)煎煮至500 mL，即得。信息見(jiàn)表1。

表1 15 批樣品信息Tab.1 Information of fifteen batches of samples

2.2 色譜條件

2.2.1 特征指紋圖譜 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?水（B），梯度洗脫（0～20 min，90%～75%A；20～50 min，75%～70% A；50～70 min，70%～68% A；70～80 min，68% A；80～90 min，68%～90%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；蒸發(fā)器溫度80 ℃；霧化器溫度50 ℃；載氣體積流量1 600 mL／min。

2.2.2 黃芪甲苷含量測(cè)定 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈?水（32∶68）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量2、10 μL（對(duì)照品）及10 μL（供試品）；蒸發(fā)器溫度50 ℃；霧化器溫度50 ℃；載氣體積流量1 400 mL／min.

2.2.3 知母皂苷BⅡ含量測(cè)定 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈?水（25∶75）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量2、10 μL（對(duì)照品）及10 μL（供試品）；蒸發(fā)器溫度50 ℃；霧化器溫度50 ℃；載氣體積流量1 400 mL／min.

2.2.4 桔梗皂苷D 含量測(cè)定 YMC?Pack ODS?A色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 pm）；流動(dòng)相乙腈?水（25∶75）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量：進(jìn)樣量2、10 μL（對(duì)照品）及10 μL（供試品）；蒸發(fā)器溫度80 ℃；霧化器溫度50 ℃；載氣體積流量1 600 mL／min.

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 對(duì)照品適量，80%甲醇制備成含0.484 8 mg／mL 黃芪甲苷的對(duì)照品溶液，30%丙酮制備成含0.498 0 mg／mL 知母皂苷BⅡ的對(duì)照品溶液，甲醇制備成含0.499 7 mg／mL 桔梗皂苷D的對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液制備

2.4.1 特征指紋圖譜 精密量取90 mL 標(biāo)準(zhǔn)煎液，加入95%乙醇至含醇量為70%，靜置過(guò)夜，醇沉液離心30 min，上清液蒸干，10 mL 蒸餾水分次溶解完全，10 000 r／min 離心10 min，吸取上清液，置于分液漏斗中，10 mL 乙酸乙酯振搖提取1 次，分取水層，水飽和正丁醇充分振搖提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇層，氨試液洗滌2 次，每次40 mL，棄去氨試液層，正丁醇液層于恒溫水浴鍋中蒸干，甲醇溶解定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4.2 特征指紋圖譜陰性 按照全處方比例藥味48.5 g，稱取相應(yīng)質(zhì)量缺黃芪、缺柴胡、缺升麻、缺桔梗、缺知母的陰性處方，按“2.1”項(xiàng)下方法制備陰性標(biāo)準(zhǔn)煎液，再按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備相應(yīng)陰性供試品溶液。

2.4.3 黃芪甲苷含量測(cè)定 精密量取標(biāo)準(zhǔn)煎液50 mL，水飽和正丁醇充分振搖提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇液，氨試液洗滌2 次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4.4 知母皂苷BⅡ含量測(cè)定 精密量取標(biāo)準(zhǔn)煎液20 mL，水浴濃縮至浸膏狀，加2 g 硅藻土分散，10 mL 30% 丙酮超聲（400 W、40 kHz）處 理10 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4.5 桔梗皂苷D 含量測(cè)定 精密量取升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液150 mL，水浴濃縮至浸膏狀，加10 g 硅藻土分散，50 mL 50% 甲醇超聲（400 W、40 kHz）處理10 min，離心30 min，取25 mL 上清液蒸干，加20 mL 水溶解，水飽和正丁醇振搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，50 mL 氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇飽和水洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.5 特征指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 取“2.3”“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)下溶液適量，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分分離度理想，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC?ELSD 色譜圖Fig.1 HPLC?ELSD chromatograms of various constituents

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液（S1），按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，以4號(hào)峰（桔梗皂苷D）為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD分別小于0.15%、1.79%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液（S1），按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、1.5、3.0、4.5、9、12、18、24 h 在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以4號(hào)峰（桔梗皂苷D）為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD分別小于0.32%、2.77%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液（S1），按“2.4.1”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以4號(hào)峰（桔梗皂苷D）為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD分別小于0.18%、3.25%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 HPLC?ELSD 特征指紋圖譜建立 取“2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液15 批，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1，將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”軟件，采用自動(dòng)匹配法生成共有模式對(duì)照?qǐng)D譜，以S1 為參照，發(fā)現(xiàn)6個(gè)共有峰，按保留時(shí)間先后依次編號(hào)1～6（圖2）。經(jīng)與對(duì)照品溶液對(duì)比，確定3號(hào)峰為知母皂苷BⅡ，4號(hào)峰為桔梗皂苷D，6號(hào)峰為黃芪甲苷，其中4號(hào)峰響應(yīng)值較高，分離度較好，保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，故選擇其作為參照峰。

圖2 15 批樣品HPLC?ELSD 特征指紋圖譜Fig.2 HPLC?ELSD characteristic fingerprints of fifteen batches of samples

保留時(shí)間窗口設(shè)定為0.5 min，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動(dòng)匹配，測(cè)得15 批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.911、0.962、0.983、0.960、0.963、0.976、0.956、0.942、0.940、0.940、0.950、0.982、0.964、0.966、0.935，表明各成分比較穩(wěn)定，對(duì)照指紋圖譜具有很好的代表性。

由圖1 可知，2號(hào)、3號(hào)（知母皂苷BⅡ）、5號(hào)峰歸屬于知母，4號(hào)（桔梗皂苷D）峰歸屬于桔梗，6號(hào)峰歸屬于黃芪，以4號(hào)峰為參照，計(jì)算6個(gè)共有峰相對(duì)峰面積，見(jiàn)表2，并計(jì)算其相對(duì)保留時(shí)間，見(jiàn)表3。由此可知，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.49%，表明對(duì)照指紋圖譜穩(wěn)定可靠，可反映標(biāo)準(zhǔn)煎液中各藥味化學(xué)特征。

表2 15 批樣品共有峰相對(duì)峰面積Tab.2 Relative peak areas of common peaks of fifteen batches of samples

表3 15 批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.3 Relative retention time of common peaks of fifteen batches of samples

2.7 各成分含量測(cè)定

2.7.1 線性關(guān)系考察 吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，知母皂苷BⅡ?qū)φ掌啡芤?.5、5、7.5、10、12.5、15 μL，桔梗皂苷D 對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，分別在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以各成分峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表4，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表4 各成分線性關(guān)系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取升陷湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S1），分別按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 峰面積RSD分別為0.26%、0.42%、0.31%，表明儀器精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取升陷湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S1），分別按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各6 份，在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芪甲苷、知母皂苷B Ⅱ、桔梗皂苷D含量RSD分別為0.63%、1.16%、0.59%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取升陷湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S1），分別按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 峰面積RSD分別為0.85%、1.28%、0.74%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 加樣回收率試驗(yàn) 取升陷湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S1），分別按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密加入含黃芪甲苷0.484 8 mg／mL、知母皂苷BⅡ0.498 0 mg／mL、桔梗皂苷D 0.499 7 mg／mL的對(duì)照品溶液1、4、1 mL，計(jì)算回收率。結(jié)果，黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 平均加樣回收率分別為95.64%、103.42%、97.42%，RSD分別為1.82%、3.34%、2.06%。

2.8 結(jié)果 取15 批升陷湯物質(zhì)基準(zhǔn)，分別按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5，色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果Tab.5 Results of content determination of various constituents

2.9 理化指標(biāo)測(cè)定 取15 批標(biāo)準(zhǔn)煎液及缺相應(yīng)藥材的陰性煎液，采用電導(dǎo)儀及實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)趁熱（50～70 ℃）測(cè)定總?cè)芙夤腆w（TDS）、鹽度、電導(dǎo)率、pH值、電位，結(jié)果見(jiàn)表6，可知各批樣品物質(zhì)基準(zhǔn)理化指標(biāo)差異不大，較為一致。因此，可通過(guò)理化指標(biāo)監(jiān)測(cè)對(duì)升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的一致性進(jìn)行判斷，要求各數(shù)值應(yīng)在表4 范圍內(nèi)波動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)該方物質(zhì)基準(zhǔn)制備過(guò)程的質(zhì)量監(jiān)控。

除加水量以全處方計(jì)外，按“2.1”項(xiàng)下方法制備缺相應(yīng)藥材的陰性煎液，測(cè)定理化指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表7。由此可知，當(dāng)煎法錯(cuò)誤時(shí)，TDS、鹽度、電導(dǎo)率與表6 相比有明顯差異，故測(cè)定理化指標(biāo)可迅速對(duì)升陷湯物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量進(jìn)行判斷，并為該方后期中間體、制劑制備及工業(yè)化大生產(chǎn)提供在線監(jiān)測(cè)的質(zhì)量研究思路，并且操作者可立即發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，從而減少煎錯(cuò)藥、少煎藥的風(fēng)險(xiǎn)。

表6 15 批樣品理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Tab.6 Results of physical and chemical index determination of fifteen batches of samples

3 討論

物質(zhì)基準(zhǔn)的指紋圖譜信息是經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)過(guò)程中主要成分遷移的重要表達(dá)［5］，主要特點(diǎn)是突出該品種與其他品種不同的特異性成分。研究表明，黃芪中黃芪甲苷可抑制哮喘發(fā)展和嚴(yán)重程度［6］、保護(hù)損傷心肌細(xì)胞［7］；對(duì)知母的考察主要集中在知母皂苷BⅡ及芒果苷、新芒果苷等成分，其中知母皂苷BⅡ具有一定促血管新生、修復(fù)受損血管的作用［8］，芒果苷可抑制缺氧復(fù)氧損傷所造成的心肌細(xì)胞活力下降及細(xì)胞凋亡［9］；桔梗中桔梗皂苷D具有明顯的鎮(zhèn)痛、抑制癌細(xì)胞作用［10?11］；柴胡中主要化學(xué)成分為皂苷類，以柴胡皂苷a、d 為代表；升麻主要含有環(huán)阿爾廷型三萜皂苷、酚酸類等成分，阿魏酸、異阿魏酸是其潛在活性物質(zhì)［12?13］。另外，黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 無(wú)紫外吸收，需采用蒸發(fā)光檢測(cè)器，而芒果苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、異阿魏酸需采用紫外檢測(cè)器，并且檢測(cè)波長(zhǎng)集中在210、260 nm。

《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》 中黃芪、知母同用的方劑共18 首，張錫純將兩者相互作用描述為“黃芪性稍熱，故以知母之涼潤(rùn)者濟(jì)之”，凸顯出復(fù)方配伍的重要性，而對(duì)使藥桔梗的作用描述為“藥中之舟楫，能載諸藥之力上達(dá)胸中，故用之為向?qū)б病?。依?jù)君臣佐使配伍原則及指標(biāo)成分檢測(cè)條件，本實(shí)驗(yàn)首先建立以黃芪、知母、桔梗為主要代表的升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液HPLC?ELSD 特征圖譜。

電導(dǎo)率是用來(lái)描述物質(zhì)中電荷流動(dòng)難易程度的參數(shù)，而純水無(wú)電導(dǎo)率，在升陷湯煎煮過(guò)程中皂苷、黃酮、多糖、無(wú)機(jī)鹽等成分透過(guò)細(xì)胞壁向水中擴(kuò)散，由此產(chǎn)生信號(hào)［14?15］。由于方中桔梗、升麻中含有較多的酚酸類物質(zhì)，故其pH 呈弱酸性。TDS 是指1 L 水中能溶解的溶解性固體量，其數(shù)值越高，表明水中溶解物越多。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)TDS、電導(dǎo)率、電位、pH值等理化指標(biāo)可實(shí)現(xiàn)升陷湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量在線監(jiān)控，并能為其他復(fù)方制劑質(zhì)量及制藥過(guò)程的一致性評(píng)價(jià)提供研究思路。