李 運(yùn) 白賀明 邱國玉 石曉峰 戴 忠

（1.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院／甘肅省種植中藥材外源性污染物監(jiān)測(cè)工程研究中心，甘肅 蘭州730000； 2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州730050； 3.中國食品藥品檢定研究院，北京100050）

杏蘇止咳糖漿具有宣肺散寒、止咳祛痰之功效，用于治療風(fēng)寒感冒咳嗽、氣逆等［1］。方中苦杏仁潤(rùn)肺化痰，降氣止咳，紫蘇葉疏風(fēng)散寒，解表宣肺，一升一降，以恢復(fù)肺的宣發(fā)肅降功能，共為君藥；前胡降氣止咳、疏散肺熱，桔梗宣肺化痰，共為臣藥；陳皮理氣化痰，為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥，全方共奏宣肺化痰、降氣止咳之效。

中藥復(fù)方制劑在質(zhì)量控制方面大多采用中藥整體控制模式［2?3］，常遴選處方中一種或幾種藥材中的主成分作為指標(biāo)建立其定性定量檢測(cè)方法［4?9］，但2020年版《中國藥典》 一部?jī)H針對(duì)杏蘇止咳糖漿中的橙皮苷含量進(jìn)行控制，另外張世勇等［10］建立HPLC 法測(cè)定其中苦杏仁苷含量；蔣亞南等［11］對(duì)其中甘草苷、橙皮苷、甘草酸的含量進(jìn)行分析。近年來，前胡受生長(zhǎng)環(huán)境、田間管理等因素的影響，存在品質(zhì)下降問題，因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定杏蘇止咳糖漿中苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素的含量測(cè)定方法，以期為更好地控制該制劑質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀，配置四元泵、2998 PDA 檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower 工作站（美國Waters 公司）；SBL?10DT超聲波恒溫清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；5424型高速離心機(jī)（德國艾本德公司）；GM?1.0A型隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Milli?Q IQ7000型超純水機(jī)（美國默克密理博公司）；XSE205DU型電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司）。

1.2 試劑與藥物 苦杏仁苷（批號(hào)110820?201506，純 度93.4%）、甘草苷（批號(hào)111610?201106，純度93.7%）、甘草酸銨（批號(hào)110731?201619，純度93.0%）、白花前胡甲素（批號(hào)111711?200602，純度100%）、白花前胡乙素（批號(hào)111904?201804，純度98.9%）對(duì)照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。杏蘇止咳糖漿共10 批（其中Y1 廠家3 批，編號(hào)為Y1?1、Y1?2、Y1?3；Y2～Y8 廠家產(chǎn)品各1 批，分別編號(hào)為Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8）。乙腈、甲醇均為色譜純；其他試劑均為分析純；水自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 CAPCELL PAK C18MG 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相水（含0.05%磷酸）（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，92%～90% A；15～20 min，90%～85% A；20～35 min，85%～80% A；35～44 min，80%～70% A；44～53 min，70%～25%A；53～66 min，25%～8%A；66～67 min，8%～92% A；67～70 min，92%A）；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm（0～21 min，苦杏仁苷）、237 nm（21～53 min，甘草苷、甘草酸）、321 nm（53～70 min，白花前胡甲素）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸銨、白花前胡甲素對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，即得（苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸銨、白花前胡甲素、白花前胡乙素質(zhì)量濃度分別為1.493、1.383、1.576、1.492、1.152 mg／mL），4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液 精密量取糖漿2.00 mL，置于10 mL 量瓶中，精密加入80%甲醇4 mL，超聲（40 kHz、300 W）提取5 min，取出，放冷至室溫，80%甲醇定容至刻度，搖勻，5 000 r／min 離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方工藝，分別制得缺苦杏仁、缺甘草、缺前胡的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分分離度理想，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，置于10 mL 棕色量瓶中，甲醇稀釋定容，搖勻，制備成系列質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液（苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素質(zhì)量濃度分別為149.3、34.99、39.22、19.99、14.75 μg／mL），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素峰面積RSD分別為2.3%、2.3%、2.2%、2.3%、2.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批糖漿（編號(hào)Y1?1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素含量RSD分別為0.36%、1.20%、1.51%、0.75%、1.96%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批糖漿（編號(hào)Y1?1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、4、8、12 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素峰面積RSD分別為0.31%、0.44%、0.43%、1.83%、2.05%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含量已知（苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素、白花前胡 乙素分別為0.980、0.580、0.735、0.120、0.007 mg／mL）的同一批糖漿（編號(hào)Y1?1）1.00 mL，共6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定 取10 批糖漿，每批2 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／mL， n＝2）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／mL， n＝2）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

3.1.1 流動(dòng)相 本實(shí)驗(yàn)考察了不同比例甲醇?水［12?13］、甲醇?水（含磷 酸）［14］、乙腈?水（含磷酸）［15］對(duì)各成分的分離效果，發(fā)現(xiàn)以乙腈?水（含0.05%磷酸）為流動(dòng)相時(shí)基線平穩(wěn)，相鄰峰達(dá)到基線分離，峰形較好。

3.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng) 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)各成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素最佳檢測(cè)波長(zhǎng)分別為207、237、321 nm，故采用波長(zhǎng)分段切換法，進(jìn)行含量測(cè)定，此時(shí)靈敏度較好，干擾較弱。

3.2 含量分析 同一廠家不同批杏蘇止咳糖漿中各成分含量較接近，但不同廠家差異較大，僅Y1中同時(shí)檢測(cè)出白花前胡甲素、白花前胡乙素，Y7中均未檢測(cè)到兩者，其余廠家僅檢出白花前胡甲素，間接反映了方中前胡投料情況。因此，對(duì)杏蘇止咳糖漿質(zhì)量的整體控制方法亟待進(jìn)一步完善，從而為臨床用藥安全提供保證。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定杏蘇止咳糖漿中苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素的含量，該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。