夏 婷袁立霞田元新羅佳波梁 曉譚曉梅

（南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州510515）

2019年12 月，新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID?19）相繼在中國和其他國家爆發(fā)，至2020年3 月2 日19 時，我國確診人數(shù)80 175 人，死亡2 915 人，國外確診人數(shù)達(dá)9 020 人，死亡人數(shù)136 人。COVID?19 初期的癥狀為干咳、乏力、反復(fù)發(fā)熱，嚴(yán)重的可導(dǎo)致呼吸困難［1］等。在目前缺乏特效藥的情況下，中藥體現(xiàn)了極大的優(yōu)勢，中醫(yī)將新冠肺炎歸為“瘟疫”范疇，為正氣不足，邪氣入侵所致［2］。明代醫(yī)家吳又可《溫疫論》 曰：“溫疫之為病，非風(fēng)非寒非暑非濕，乃天地間別有一種異氣所感”這里既寫出了瘟疫的病因病機(jī)，也說明了瘟疫在辨證治療上的特點，為感“毒”而發(fā)，所以治當(dāng)排毒祛邪。肺腸同治，即是在“肺與大腸相表里”的理論指導(dǎo)下，對于新型冠狀病毒感染的肺炎的治療應(yīng)考慮在疫毒邪盛時表里雙解，宣肺透邪，通腑泄熱。

葛根芩連湯出自《傷寒論》，為解表清里的代表方劑，由葛根、黃芩、黃連和甘草組成，有清熱燥濕、解表清里之功［3］。方中重用葛根為君，葛根甘辛而涼，主入陽明經(jīng)，外解肌表之邪，內(nèi)清陽明之熱，升發(fā)脾胃清陽而止瀉升津；臣以黃芩、黃連清熱燥濕，二藥味苦性寒，性寒能清胃腸之熱，味苦可燥腸胃之濕；甘草甘緩和中、清熱解毒、止咳祛痰為佐使藥［4?7］。四藥合用，外疏內(nèi)清，表里同治，根據(jù)其功能主治與組方配伍理論適用于新型冠狀病毒感染肺炎之表邪未解，里熱熾盛之證。由葛根芩連湯開發(fā)的制劑葛根芩連丸為藥典收載品種，為衛(wèi)生部《傳染性非典型肺炎（severe acute respiratory syndrome，SARS）診療方案》（2003年）和衛(wèi)生部《人禽流感診療方案（2005 版）》 及衛(wèi)生部《甲型H1N1 流感診療方案（2009年試行版第一版）》 推薦用藥。課題組前期研究證實葛根芩連湯具有抗多種病毒的作用［8?9］，還有抗炎、止咳、解熱作用［10］，由此提示葛根芩連湯可用于新型冠狀病毒感染肺炎的治療。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是生物學(xué)、藥理學(xué)和信息學(xué)等多學(xué)科結(jié)合的一門科學(xué)，強(qiáng)調(diào)對信號通路、多成分?多靶點進(jìn)行分析研究［11］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)闡明葛根芩連湯治療新冠肺炎引起的干咳、發(fā)熱和呼吸困難的活性成分、靶標(biāo)、作用機(jī)制，以期為COVID?19 的用藥提供新思路。

1 方法

1.1 葛根芩連湯復(fù)方成分搜索 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）（http：／ ／tcmspw.com／tcmsp.php）分別以葛根、黃芩、黃連和甘草作為搜索關(guān)鍵詞，得到葛根芩連湯的化學(xué)成分。

1.2 復(fù)方活性化合物及靶標(biāo)蛋白的篩選 口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）是藥物吸收、分布、代謝、排泄最重要的藥動學(xué)參數(shù)之一，它表示口服藥物的有效成分或活性基被吸收到達(dá)體循環(huán)并吸收的速度與程度，OB值越高通常表示藥物的生物活性越好和類藥性（Drug?likeness，DL）越好。借助TCMSP 數(shù)據(jù)平臺，篩選出葛根、黃芩、黃連、甘草所含化合物中符合OB≥30%且DL≥0.18 的化學(xué)成分作為活性成分，并得到相關(guān)靶標(biāo)蛋白。

1.3 COVID?19 引起的干咳、發(fā)熱、呼吸困難靶點篩選 在Drug Bank（https：／ ／www.drugbank.ca／）數(shù)據(jù)庫中輸入“dry cough”“tussiculation”“pyrexia”“dyspnea”為關(guān)鍵詞獲得干咳、發(fā)熱、呼吸困難的靶點。將上述成分靶點與疾病相關(guān)靶點取交集，分別獲得葛根芩連湯治療干咳、發(fā)熱和呼吸困難的作用靶點，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 靶標(biāo)蛋白基因名的確定及藥材?化合物?靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 借助Uniprot（https：／ ／www.uniprot.org／）數(shù)據(jù)庫查詢靶標(biāo)蛋白對應(yīng)的基因名和ID號，并用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建化合物?靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，分析化合物和靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.5 靶點的通路分析 為了進(jìn)一步了解上述篩選出的靶標(biāo)蛋白基因的功能以及在信號通路中的作用，將篩選得到的葛根芩連湯作用的靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／david.ncifcrf.gov／），通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱（official gene symbol），經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作，設(shè)定閾值P＜0.05，進(jìn)行GO 生物學(xué)過程富集分析和KEGG 信號通路富集分析，并將結(jié)果可視化。

1.6 主要活性成分?目標(biāo)分子對接 將化合物?靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析中度值大，且蛋白結(jié)構(gòu)為“人”的靶點ADRB2 與上述互作關(guān)系成分進(jìn)行分子對接。通過ChemBioDraw 軟件繪制分子結(jié)構(gòu)后，導(dǎo)入軟件Sybyl?X 1.1 進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、加氫處理及Minimize 能量優(yōu)化，結(jié)果保存為mol2 文件格式。從PDB 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.rcsb.org／）下載ADRB2 的3D 結(jié)構(gòu)（*PDB 格式，ID 為3D4S），去除水分子、加氫和除側(cè)鏈的殘基后，采用Sybyl?X 1.1 對接軟件的Surflex?Dock 程序與核心化合物進(jìn)行對接并打分，以ligand 作為對照，參數(shù)均為默認(rèn)參數(shù)。Surflex?Dock 打分函數(shù)是以log（KD）為單位表示結(jié)合作用力，打分越高，說明配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的搜索 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到葛根、黃芩、黃連和甘草中化合物，其中葛根18個、黃芩58個、黃連33個、甘草280個，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18 為篩選條件，得到133個活性化合物，其中葛根5個、黃芩26個、黃連10個、甘草92個。通過化合物?靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，葛根芩連湯中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點較大的部分活性化合物見表1。

表1 葛根芩連湯部分活性化合物基本信息

2.2 化合物?靶點相互作用網(wǎng)絡(luò) 在葛根芩連湯?干咳的化合物?靶點網(wǎng)絡(luò)中，復(fù)方中17個化合物對應(yīng)76個靶點，紅色圓點表示中心度值較大的活性化合物和靶點，主要包括甘草成分MOL004810?粗毛甘草素F、MOL000500?維斯托爾、MOL005007?糖精蛋白M，黃芩成分MOL002927?黃芩黃酮Ⅱ、MOL002911?2，6，2’，4’ ?四羥基?6’ ?甲氧基查耳酮；主要靶點包括SCN5A、ACHE、ADRA1B、CHRM1、SLC6A4 等。葛根芩連湯?發(fā)熱的化合物?靶點網(wǎng)絡(luò)中，包含18個化合物及65個相應(yīng)靶點，中心度值較大的化合物主要包括葛根成分MOL001999?濱蒿內(nèi)酯、MOL000392?芒柄花黃素，黃芩成分MOL002917?5，2，6?三羥基?6，7 甲氧基黃酮，關(guān)鍵靶點為ADRA1B、ADRB2、PTGS1、PTGS2、PPARG 等；葛根芩連湯?呼吸困難的化合物?靶點網(wǎng)絡(luò)中，包含20個化合物及45個相應(yīng)靶點，中心度值較大的化合物包括甘草成分 MOL002311?甘草酚，黃芩成分MOL002927?黃芩黃酮Ⅱ，關(guān)鍵靶點為ADRA1A、ADRA1B、ADRB2、MAOB 等。見圖1。

圖1 葛根芩連湯化合物?靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 靶點通路可視化 通過數(shù)據(jù)庫DAVID 進(jìn)行的GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 富集分析包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）3個分支，對干咳有關(guān)的靶點進(jìn)行分析，設(shè)定閾值P＜0.05，共富集到GO 條目77 條，其中生物過程（BP）條目45個，細(xì)胞組成（CC）條目17個，分子功能（MF）條目15個，分別占58.4%、22.1%、19.5%，KEGG 通路富集篩選得到8 條信號通路，涉及神經(jīng)活性配體?受體相互作用通路、鈣信號通路、膽堿能突觸通路等，均涉及OPRM1、CHRM4、CHRM3、CHRM2、CHRM1、ADRA1B、ADRA1A、CHRNA7、ADRA1D、CHRNA2 等靶點，見圖2。

圖2 葛根芩連湯緩解干咳癥狀化合物靶點GO 功能分析、KEGG 通路分析

與發(fā)熱相關(guān)靶點中，設(shè)定P＜0.05，共富集到GO 條目93個，其中生物過程（BP）條目67個，細(xì)胞組成（CC）條目8個，分子功能（MF）條目18個，分別占72.0%、8.6%、19.4%，KEGG 通路富集篩選得到19 條信號通路，涉及心肌細(xì)胞腎上腺素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體?受體相互作用通路，均涉及ADRB2、ADRA1B、ADRA1A、ADRA1D 等靶點，見圖3。

圖3 葛根芩連湯緩解發(fā)熱癥狀化合物靶點GO 功能分析、KEGG 通路分析

涉及呼吸困難的靶點中，富集得到GO 條目18個（P＜0.05），其中生物過程（BP）條目12個，細(xì)胞組成（CC）條目4個，分子功能（MF）條目2個，分別占66.7%、22.2%、11.1%，KEGG 通路富集篩選得到7 條信號通路，涉及心肌細(xì)胞腎上腺素信號通路、cGMP?PKG 信號通路、鈣信號通 路，均涉及 ADRB2、ADRA1B、ADRA1A、ADRA1D 等靶點，見圖4。

圖4 葛根芩連湯緩解呼吸困難化合物靶點GO 功能分析、KEGG 通路分析

2.4 分子對接結(jié)果 將處理好的活性化合物與ADRB2 對接，對應(yīng)的化合物作為配體，Surflex?Dock 程序打分＞5.0的認(rèn)為化合物與靶點蛋白具有較強(qiáng)的親合力。結(jié)果表明，ADRB2 與化合物5，2，6?三羥基?6，7 甲氧基黃酮、黃芩黃酮Ⅱ、維斯托爾具有較好的親合力，分子對接模式見圖5，各化合物得打分結(jié)果見表2。

圖5 ADRB2 與互作關(guān)系成分分子對接模型圖

表2 ADRB2 與其對應(yīng)的小分子化合物的對接得分

3 討論

新型冠狀病毒肺炎COVID?19 屬于中醫(yī)學(xué)疫病范疇，正氣不足，邪氣入侵為其主要致病因素，化熱入里為重要病機(jī)轉(zhuǎn)歸。目前對COVID?19 的中醫(yī)分析，該病早期病因為“濕毒疫”，病位在中焦［12］，表現(xiàn)為干咳、反復(fù)發(fā)熱、呼吸困難，葛根芩連湯外疏內(nèi)清、解肌透表、清熱解毒、可用于表邪入里引起的乏力、發(fā)熱、干咳等；現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果顯示方中葛根具有退熱作用，可用于治療發(fā)熱頭疼［13］；黃芩具有消炎、抗氧化、抗病毒作用，在全國各省區(qū)中醫(yī)藥治療新型冠狀病毒肺炎（COVID?19）的診療方案中，黃芩為治療COVID?19 早期咳嗽、發(fā)熱的高頻藥物之一［14］；黃連可通過作用腸道菌群調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力而改善機(jī)體癥狀［15?16］；甘草具有免疫調(diào)節(jié)、化痰止咳作用［17］。四味藥組方可改善新型冠狀肺炎引起的發(fā)熱、干咳、呼吸困難、腹瀉等臨床癥狀。首例新型冠狀病毒肺炎死亡的尸檢報告顯示，患者死亡多由肺內(nèi)痰栓導(dǎo)致缺氧而死［18］，提示該方可以對于COVID?19 咳嗽和痰栓起到止咳化痰作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示，葛根芩連湯對干咳、發(fā)熱和呼吸困難均有治療作用，網(wǎng)絡(luò)表明方中治療干咳的主要藥物為甘草、黃芩，甘草、黃芩祛痰止咳、清肺熱，可用于COVID?19 的治療。葛根芩連湯改善COVID?19 引發(fā)的干咳，可能通過調(diào)節(jié) SCN5A、ACHE、ADRA1B、CHRM1、SLC6A4 等靶點作用于神經(jīng)活性配體?受體相互作用通路、鈣信號通路、膽堿能突觸通路；復(fù)方中治療發(fā)熱的主要藥物為葛根、黃芩，葛根、黃芩均是解肌退熱的常用藥物，可能通過調(diào)節(jié)ADRA1B、ADRB2、PTGS1、PTGS2、PPARG等靶點作用于心肌細(xì)胞腎上腺素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體?受體相互作用通路，達(dá)到退熱的效果；網(wǎng)絡(luò)顯示復(fù)方中緩解呼吸困難癥狀的藥物主要為黃芩、甘草，黃芩、甘草可能通過改善肺部功能從而改善呼吸困難癥狀，但以上作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

分子對接結(jié)果表明，核心化合物主要通過氫鍵，π?π共軛及范德華力相互作用與ADRB2，即β2腎上素腺能受體結(jié)合，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞腎上腺素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、膽堿能突觸通路等改善COVID?19 引發(fā)的干咳、發(fā)熱和呼吸困難等癥狀。研究表明黃芩素、芒柄花素、漢黃芩素、小檗堿、黃連堿等可用于治療新型冠狀病毒肺炎［19?21］，且以上成分均為葛根芩連湯主要活性成分，以期為葛根芩連湯改善新型冠狀病毒肺炎臨床癥狀提供理論依據(jù)。

在目前還未有針對新型冠狀病毒肺炎特效藥的形勢下，中醫(yī)藥多成分，多靶點相互作用的治療特點取得了低死亡率、高治愈率的顯著成果。應(yīng)理性科學(xué)開展新冠肺炎中藥臨床研究，對于有效藥物，可考慮先治療，再評估［22］。葛根芩連湯作為古代經(jīng)典名方之一，有豐富的臨床用藥經(jīng)驗及用藥歷史，安全性和有效性得到充分肯定，無明顯不良反應(yīng)，可用于輕型和普通型患者的治療；且葛根芩連復(fù)方目前已有中成藥出售，大大提高了藥物供給效率。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對葛根芩連湯治療COVID?19 引起的干咳、發(fā)熱及呼吸困難的活性成分、靶點及通路進(jìn)行分析研究，葛根芩連湯通過多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用來發(fā)揮療效。介于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的局限性，后期可對活性成分?靶點?通路進(jìn)行實驗驗證研究，以期為葛根芩連湯治療COVID?19 提供依據(jù)。