張 鴻，李 偉，王 輝，侯 峰，劉 斐，史孟杰

(陜西省人民醫(yī)院 血管外科，陜西 西安710068)

神經(jīng)纖毛蛋白-1(NRP1)是神經(jīng)纖毛蛋白家族中的一種跨膜非酪氨酸激酶蛋白，在血管生成、神經(jīng)軸突生長和腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用[1-2]。NRP1在惡性腫瘤的表達可通過觸發(fā)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和其他途徑促進腫瘤增殖、血管生成和轉移[3]。近期的研究證實NRP1信號介導的Treg在腫瘤內(nèi)的蓄積可能在加劇荷瘤小鼠缺血性腦損傷中起關鍵作用，并且可能作為癌癥和中風合并癥的免疫調(diào)節(jié)靶標[4]。提示NRP1可調(diào)節(jié)免疫細胞從而影響腫瘤細胞的增值轉移。在胃癌中，NRP1的高表達與腫瘤進展的發(fā)展密切相關，并與總生存率較差相關[5]。在胃癌中，腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫細胞浸潤同樣發(fā)揮重要作用。一項研究表明，胃癌T細胞亞群密度高與患者生存延長有關[6]。此外，人們認為自然殺傷細胞和樹突狀細胞是胃癌免疫治療的潛在靶點[7]。本研究通過生物信息學分析，擬證實NRP1基因通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞的浸潤來影響胃癌的預后。為胃癌的免疫治療提供更多的治療靶點。

1 生物信息分析方法

1.1 TIMER(Tumor Immune Estimation Resource)數(shù)據(jù)庫

TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是用于系統(tǒng)分析各種癌癥類型的免疫浸潤的綜合數(shù)據(jù)庫[8]。可以通過在所有TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫腫瘤中使用Diff Exp模塊來區(qū)分腫瘤與鄰近正常組織之間靶基因的差異表達。本研究中，我們TIMER數(shù)據(jù)庫分析了NRP1在泛癌中的表達，同時通過腫瘤免疫估計分析了胃癌患者中6種類型的浸潤免疫細胞(B細胞，CD4+T細胞，CD8+T細胞，中性粒細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞)的豐富度，分析了NRP1表達及其相關性。并且使用Wilcoxon檢驗評估NRP1表達的統(tǒng)計學顯著性，多因素分析NRP1表達、腫瘤純度以及免疫細胞浸潤對患者預后的影響，P值<0.05認為具有統(tǒng)計學差異。

1.2 Kaplan-Meier plotter

Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫[9](https://www.kmplot.com) 用于分析有關基因表達與惡性腫瘤患者預后的關系。本研究分析了NRP1基因 mRNA 表達水平對胃癌患者的至第一次進展時間(FP)和總生存期(OS)的影響，將患者樣本按最佳分界值(高表達與低表達)分為兩組，并繪制生存曲線，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織中 NRP1 基因 mRNA 差異表達及預后

本研究使用 TIMER 數(shù)據(jù)庫比較了不同類型惡性腫瘤和配對的正常組織中 NRP1 的轉錄水平。分析顯示，NRP1 在胃癌正常及腫瘤組織中均表達，且胃癌腫瘤組織 vs 正常組織表達具有統(tǒng)計學意義(P<0.001),見圖 1。

另外，基于Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫我們進一步證實，NRP1 基因高表達的胃癌患者擁有較差的至第一次復發(fā)時間(24.3月對比49.5月，P=0.0059)，同樣的，NRP1高表達預示患者總生存期較差(34.7月對比70.4月，P=0.0036)，見圖2。

2.2 NRP1表達與6種浸潤性免疫細胞的相關性分析

通過分析NRP1表達與6種浸潤性免疫細胞的相關性，發(fā)現(xiàn)NRP1表達與胃癌腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞浸潤相關，其中與腫瘤純度呈負相關(r=-0.173,P=7.21e-04)，其表達與胃癌微環(huán)境中CD8+T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性類細胞呈正相關，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但是，與B細胞浸潤無關(r=-0.124,P=1.74e-02)。該研究證實NRP1與胃癌免疫微環(huán)境中的免疫細胞的浸潤存在相關性，見圖3。

2.3 NRP1的SCNA(Somatic Copy Number Alterations)與免疫浸潤的相關性

免疫監(jiān)視在確定各種類型癌癥的預后中的重要性已被廣泛接受。為了進一步檢查NRP1的基因組指標與胃癌中免疫浸潤程度之間的相關性，通過GISTIC 2.0定義了SCNA。在這項基因組數(shù)據(jù)研究中，具有NRP1基因SCNA的胃癌被分為5個級別，包括深度缺失、臂級缺失、正常、臂級獲得和高擴增。我們評估了所有胃癌的SCNA 6種免疫細胞的浸潤情況，包括B細胞，CD4+T細胞，CD8+T細胞，巨噬細胞，中性粒細胞和樹突狀細胞。結果表明，NRP1的SCNA的臂級獲得與6種免疫細胞的浸潤均相關(P<0.05)，見圖4。

圖1 TIMER分析各種類型的惡性腫瘤組織和正常組織中NRP1的表達

圖2 胃癌中NRP1表達水平對患者預后的影響

圖3 胃癌中NRP1基因表達與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤之間的相關性

2.4 NRP1表達與免疫細胞浸潤對胃癌患者預后的影響

TIMER中的多因素生存分析顯示(圖5)，在胃癌中，NRP1表達是影響其預后的獨立的影響因素(HR:1.43,95%置信區(qū)間：1.13-1.82，P=0.003)。巨噬細胞浸潤同樣影響胃癌患者的預后(HR:76.53,95%置信區(qū)間：3.43-1705.40，P=0.004)。

3 討論

NRP1參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生和癌癥的發(fā)病機制，在血管生成中同樣發(fā)揮重要作用。研究表明，NRP1在包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細胞中特異性高表達。NRP1可以通過誘導一系列細胞內(nèi)信號級聯(lián)來參與腫瘤的發(fā)展，促進腫瘤的轉移[10-11]。已發(fā)表的數(shù)據(jù)表明，對NRP1表達水平的分析可以為胃癌患者的預后提供預測指標[5]。此外，NRP1也是癌癥治療的令人期待的潛在治療靶點[12]。本文通過生物信息學分析，證實NRP1在胃癌中特異性高表達，且其為胃癌預后預測的獨立影響因子，提示其可作為胃癌靶向治療的潛在靶點。

圖4 胃癌中NRP1基因SCNA類型與免疫細胞哦浸潤之間的關系

圖5 免疫微環(huán)境中免疫細胞浸潤對胃癌患者預后的影響

關于NRP1表達與胃癌患者臨床患者預后之間的關系目前尚無定論。多項研究檢測了NRP1蛋白在胃癌中的表達，分析了NRP1蛋白異常表達與胃癌臨床病理特征的關系。楊等人的研究[13]證明NRP1表達與胃癌的淋巴結轉移呈正相關，有些研究卻得出相反的結論[14]。一項研究證實，高表達NRP1和PDGFRB的胃癌患者比其他患者的死亡風險增加近兩倍[5]。一項薈萃分析來評價NRP1蛋白的表達與胃癌的臨床病理特征之間的相關性，此研究共納入12項研究，包括1225名胃癌患者。結果表明，腫瘤大于5 cm的胃癌NRP1蛋白表達陽性率高于腫瘤小于5 cm的胃癌，Ⅲ-Ⅳ期高于Ⅰ-Ⅱ期，低分化高于良好/中度分化，淋巴結轉移高于無淋巴結轉移[15]。本研究結論與上述研究相似，即NRP1高表達是胃癌預后不佳的預測因子。

本研究證實，NRP1表達與胃癌腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞浸潤相關，其中與CD8+T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞浸潤呈正相關。與B細胞浸潤無關。提示NRP1與免疫細胞的浸潤存在相關性，可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤在腫瘤浸潤性免疫細胞可通過直接或間接參與免疫應答和血管生成影響腫瘤患者的預后。例如，樹突狀細胞可以捕獲和呈現(xiàn)腫瘤細胞釋放的抗原；CD8+T細胞可以溶解和吞噬腫瘤細胞[16-18]。上述研究提示實體腫瘤與腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫細胞浸潤有關，可顯著影響治療療效和整體生存率。

巨噬細胞浸潤與惡性腫瘤之間的相關性是目前研究的熱點問題。眾所周知，巨噬細胞是一種多用途的細胞，在不同的趨化因子刺激下，可以極化為促炎巨噬細胞M1和免疫抑制巨噬細胞M2[19]。 其中M1和M2均參與腫瘤進展過程，但M1通過激活毒性中間體和活性氧中間體的產(chǎn)生，主要起保護因素，而M2則是其促進腫瘤進展和轉移的危險因素[20-21]。巨噬細胞M0具有與M1相似但稍弱的功能。一項旨在探索免疫微環(huán)境免疫浸潤與胃癌預后的相關性的研究并未得出理想的結果，巨噬細胞與胃癌患者病理分期有關，但是與胃癌患者的總生存期無關[22]。在本研究中，巨噬細胞浸潤與胃癌的預后呈負相關，結合前面的結果，NRP1表達與巨噬細胞呈正相關，提示，NRP1可能與巨噬細胞相互作用，導致胃癌進展。具體的結論尚需后續(xù)的分子實驗證實。

綜上所述，本研究利用生物信息學分析證實，NRP1可作為胃癌患者的一個重要的臨床生物標志物和免疫治療靶點提供了全面的證據(jù)。NRP1轉錄水平與胃癌的生存結局和腫瘤浸潤免疫細胞顯著相關。NRP1可能在腫瘤免疫細胞的浸潤中發(fā)揮重要作用，并可作為胃癌的預后生物標志物加以應用。