龔海蓉，陳婷玉

福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 福建福州 350101

5-氟 尿 嘧 啶（5-fluorouracil ，5-FU）的 臨 床治療仍因其骨髓抑制和胃腸道毒性受限[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為化療后胃腸黏膜損傷（Chemothrapy induced gastrointestinal Mucositis，CIGIM）基本病機(jī)為脾失健運(yùn)，水濕蘊(yùn)結(jié)，益氣健脾中醫(yī)藥可立足于病機(jī)緩解CIGIM[2]。但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不完全明確。近年研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，以白細(xì)胞介素 1β（Interleukin 1β，IL-1β）為典型的血清促炎因子是胃腸黏膜炎癥反應(yīng)的重要損傷因素；而IL-10則是炎癥反應(yīng)鏈中拮抗IL-1β等的首要細(xì)胞因子。因此，本實(shí)驗(yàn)使用益氣健脾化濕藥膳參芪薏苡仁粥干預(yù)CIGIM大鼠，通過(guò)觀察大鼠胃腸黏膜組織形態(tài)血清及IL-10、IL-1β蛋白表達(dá)水平，探討參芪薏苡仁粥對(duì)CIGIM大鼠的可能作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，體重250～300g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 黨參10g，黃芪20g，薏苡仁20g，大棗10g，生姜12g，購(gòu)自國(guó)醫(yī)堂。

1.3 實(shí)驗(yàn) 試 劑 5-FU 注 射 液、Rat IL-1β ELISA Kit、Rat IL-10 ELISA Kit購(gòu)自聯(lián)科生物。

2 實(shí)驗(yàn)方法

將36只大鼠隨機(jī)分成模型組、藥膳組和空白組，每組12只。模型組及藥膳組給予5-FU150mg/kg一次性腹腔注射，制作化療大鼠模型；空白組使用等量生理鹽水腹腔注射。實(shí)驗(yàn)期間藥膳組大鼠行參芪薏苡仁粥10ml/kg/d灌胃，模型組及空白組行生理鹽水10ml/kg/d灌胃，1次/d，干預(yù)周期15d。

3 指標(biāo)評(píng)價(jià)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取胃、回腸組織，采用HE染色法制作大鼠胃、回腸組織切片。參考Masuda標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法[6]、Chiu腸黏膜損傷評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]對(duì)分別胃、腸黏膜損傷程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。留取大鼠血清標(biāo)本，采用Elisa法檢測(cè)IL-10和IL-1β細(xì)胞因子水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、卡方檢驗(yàn)或Nemenyi檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

1 大鼠胃黏膜病理結(jié)構(gòu)改變

模型組、空白組及藥膳組大鼠胃黏膜病理?yè)p傷評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2=3.627，P=0.163），胃黏膜損傷積分模型組>藥膳組>空白組（見(jiàn)圖1）。顯微鏡下觀察3組胃黏膜絨毛形態(tài)（見(jiàn)圖3），3組間模型組缺損最嚴(yán)重；藥膳組和空白組比較，絨毛致密程度無(wú)明顯差別，但空白組黏膜邊緣較整齊。

圖1 大鼠胃黏膜Masuda評(píng)分比較

圖3 大鼠胃黏膜HE染色鏡下（200×）

2 大鼠回腸黏膜病理結(jié)構(gòu)改變

模型組、空白組及藥膳組大鼠回腸黏膜病理?yè)p傷評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.763，P=0.056）；空白組損傷積分低于模型組和藥膳組，藥膳組和模型組積分無(wú)差別（見(jiàn)圖2）?；啬c黏膜HE染色鏡下結(jié)構(gòu)對(duì)比結(jié)果顯示（見(jiàn)圖4）：模型組腸絨毛空泡明顯，絨毛腫脹甚至斷裂；與空白組比較，藥膳組腸絨毛頂端缺損，游離紅細(xì)胞數(shù)量較多。

圖2 大鼠腸黏膜Chiu評(píng)分比較

圖4 大鼠回腸黏膜HE染色鏡下（200×）

3 大鼠血清IL-10、IL-1β表達(dá)水平

摸索 IL-10、IL-1β 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，（見(jiàn)圖5、6），R2>0.99，可用于計(jì)算樣品濃度。Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3組間IL-1β蛋白表達(dá)水平有明顯差異（P<0.01），模型組IL-1β蛋白濃度明顯高于藥膳組和空白組，藥膳組IL-1β蛋白水平與空白組比較無(wú)明顯差別（見(jiàn)圖7）；3組大鼠IL-10蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），藥膳組血清IL-10含量高于模型組和空白組，以模型組蛋白表達(dá)水平最低（見(jiàn)圖8）。

圖5 IL-10標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖8 3組大鼠血清IL-10蛋白表達(dá)水平

討 論

5-FU引發(fā)胃腸黏膜損傷的本質(zhì)是化療藥阻滯胃腸黏膜上皮細(xì)胞DNA合成，使黏膜屏障功能受損，從而引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)，形成CIGIM。IL-1β作為促炎因子IL-1主要亞型，主要由巨噬細(xì)胞分泌；IL-10可由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，它可以抑制炎癥細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，與IL-1β互相拮抗。研究發(fā)現(xiàn)[8]，NLRP3/caspase-1、NF-kB、STAT3和MAPK等多條反應(yīng)鏈參與IL-1β與IL-10調(diào)控。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶 1（caspase-1）作為上游活化蛋白，可將Pro-IL-1β結(jié)合體分解為有活性 IL-1β，IL-1β借助NLRP3炎癥小體介導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)，形成NLRP3/IL-1β級(jí)聯(lián)反應(yīng)鏈[9]。參芪薏苡仁粥君藥黃芪有效成分主要包括黃芪甲苷和黃芪多糖，黃芪甲苷可抑制NLRP3/IL-1β軸改善大鼠血管及平滑肌炎癥反應(yīng)[10]。腸道炎癥反應(yīng)過(guò)程中的脂多糖及其蛋白復(fù)合物可與巨噬細(xì)胞膜上的 CD14 特異性結(jié)合，通過(guò) TLR/ NF-κB 路徑激活巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等早期炎癥因子[11]。隨著TNF-α水平升高，刺激NF-κB結(jié)合蛋白TLR表達(dá)，經(jīng) TLR/ NF－ κB 通路下游 MyD88信號(hào)的配體增加IL-6和IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)[12]。文獻(xiàn)表明[13-14]，黃芪多糖及黃芪甲苷可顯著降低LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞反應(yīng)程度，降低 TNF-α及IL-1β水平。黃芪甲苷可明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎腸道炎癥損傷，改善腸道菌群環(huán)境，其作用方式可能與調(diào)控TLR/NF-κB信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白有關(guān)[15]。

圖6 IL-1β標(biāo)準(zhǔn)曲線

研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量，增加 IL-10 的表達(dá)[16]。IL-10 / IL-10 受體相互作用涉及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑激酶1（JAK1）、酪氨酸激酶2（Tyk2）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），JAK和Tyk2同屬JAK體系，與STAT家族各亞型一起參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，JAK/STAT3通路活化后誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)，通過(guò)阻斷NF-κB核易位，抑制細(xì)胞因子IL-6和IL-1β的分泌以及細(xì)胞因子的表達(dá)[17]。而黃芪能有效抑制JAK1和Tyk2的活性[18-19]。巨噬細(xì)胞對(duì)M1（炎癥性）或M2（抗炎性）的極化受信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，AMPK是參與產(chǎn)生IL-10M2表型極化的信號(hào)分子之一。AMPKα是IL-10介導(dǎo)的PI3K / Akt和STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)必備介質(zhì)，MAPK相關(guān)蛋白水平降低可增加IL-10基因表達(dá)[20]。黃芪通過(guò)抑制 MAPK通路上游啟動(dòng)蛋白ERK、p38的表達(dá)，降低通路活化程度，增加Il-10生成[21-23]。除黃芪，藥膳中的配伍用藥黨參、薏苡仁等可調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠IL-6與IL-10平衡，緩解腸道病理?yè)p傷[24-25]。

本研究結(jié)果顯示，3組大鼠胃黏膜、回腸黏膜損傷評(píng)價(jià)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與以下原因有關(guān)：5-FU 致胃腸黏膜損傷模型大鼠存在自我修復(fù)機(jī)制，在實(shí)驗(yàn)周期設(shè)計(jì)上，應(yīng)進(jìn)一步參考大鼠的生理特點(diǎn)及CIGIM修復(fù)機(jī)制。同時(shí)，可增設(shè)偽無(wú)菌小鼠模型，避免腹腔注射等可能導(dǎo)致胃腸道損傷的干擾因素。本次研究在取材過(guò)程發(fā)現(xiàn)不同組別大鼠胃腸黏膜厚度、胃體大小存在差別，今后研究在評(píng)價(jià)指標(biāo)中可增加胃黏膜厚度、毛細(xì)血管充血程度、黏膜大體形態(tài)觀察，進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)效果。文獻(xiàn)表明，5-FU對(duì)胃腸黏膜損傷具有劑量相關(guān)性，單次腹腔注射400 mg/kg或以50 mg/kg連續(xù)腹腔注射5d均可復(fù)制化療模型，造模劑量界定亦有可能是導(dǎo)致本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響因素[26]。

綜上所述，參芪薏苡仁粥可能通過(guò)調(diào)控IL-1β與IL-10表達(dá)水平修復(fù)化療后胃腸黏膜損傷，但是介導(dǎo)IL-10和IL-1β的分子通路較多，后續(xù)研究可進(jìn)一步探討不同通路具體的作用機(jī)制。