胡 陽 宋莉萍 汪愛華* 梁紅艷 邱文兵 蔡美仲 崔曉培 高長斌 周國林 李 平*

（1 荊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北荊州 434007；2 武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北武漢 430070）

普通白菜〔Brassica campestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino var.communisTsen et Lee〕為十字花科蕓薹屬白菜亞種一年生或二年生草本植物，俗稱小油菜、青菜。常規(guī)普通白菜的葉片和薹莖表皮覆有較厚的蠟質(zhì)，色澤多為綠色或暗綠色且無光澤，而亮綠普通白菜的葉片和薹莖表皮蠟質(zhì)極少、呈亮綠色有光澤。亮綠突變體的發(fā)現(xiàn)對(duì)于豐富普通白菜種質(zhì)資源和新品種選育具有十分重要的意義，研究其遺傳規(guī)律并定位突變基因可為普通白菜薹莖亮綠性狀在育種中的應(yīng)用和基因的克隆提供理論基礎(chǔ)。

植物表皮蠟質(zhì)可分為內(nèi)表皮蠟質(zhì)和外表皮蠟質(zhì)，內(nèi)表皮蠟質(zhì)填充于角質(zhì)層內(nèi)，外表皮蠟質(zhì)在角質(zhì)層外層組裝成不同形態(tài)的蠟質(zhì)晶體（包括片狀、絲狀、棒狀、管狀、顆粒狀等）（Eglinton & Hamilton，1967；Barthlott et al.，1998；Jenks et al.，2002；Jetter et al.，2006）。許多植物表皮均覆有一層蠟質(zhì)，其蠟質(zhì)組成和含量會(huì)因?yàn)槲锓N及其器官的不同而有所變化，同一植物因生長時(shí)期、組織器官不同，其蠟質(zhì)成分和含量也有所差異（Post-Beittenmiller，1996；Jetter & Sch?ffer，2001）。植物表皮的蠟質(zhì)生物合成及運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，突變體材料由于蠟質(zhì)總量的減少或組分的改變而呈現(xiàn)亮綠有光澤的表型（Aarts et al.，1995）。Dellaert（1979）報(bào)道了第1 個(gè)擬南芥蠟質(zhì)突變體eceriferum（cer），此后在許多植物中均開展了蠟質(zhì)遺傳和基因方面的研究。對(duì)不同植物的蠟質(zhì)遺傳規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)缺失或減少的遺傳以單基因隱性遺傳為主（Anstey & Moore，1954；Tatlioglu，2006；Farnham，2010；Zhang et al.，2013a；Liu et al.，2017a），單基因顯性遺傳（Mo et al.，1992；Pu et al.，2013；Tang et al.，2015；Liu et al.，2017b）、不完全顯性遺傳（Priestley & Wills，1966）和雙基因隱性遺傳（周熙榮 等，1995；Zhang et al.，2013b）較少。對(duì)蠟質(zhì)合成及代謝相關(guān)基因的研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中的CER1、CER2、CER3、CER4、CER6/CUT1、CER8、WAX2、WIN1等基因（Aarts et al.，1995；Hannoufa et al.，1996；Negruk et al.，1996；Xia et al.，1996；Fiebig et al.，2000；Hooker et al.，2002；Chen et al.，2003；Broun et al.，2004；Rowland et al.，2006；Lü et al.，2009；Bernard et al.，2012），水稻中的WSL1、WSL2、WSL3、WSL4、OsGL1-1等基因（Yu et al.，2008；Qin et al.，2011；Mao et al.，2012；甘露，2016），玉米中的GL1、GL2、GL8等基因（Xu et al.，1997；Velasco et al.，2002；Sturaro et al.，2005）參與編碼蠟質(zhì)合成或代謝相關(guān)的酶或蛋白質(zhì)。本試驗(yàn)以2015 年3 月在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)基地發(fā)現(xiàn)的薹莖亮綠的普通白菜突變體自交系Q161 和常規(guī)有蠟質(zhì)自交系Q195 為親本，構(gòu)建6 世代群體，對(duì)普通白菜薹莖亮綠性狀遺傳規(guī)律進(jìn)行分析；利用BSA-seq 技術(shù)結(jié)合雙親的InDel 標(biāo)記開發(fā)，對(duì)控制薹莖亮綠性狀的基因進(jìn)行初定位研究，以期為普通白菜薹莖亮綠基因的克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017—2019 年在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行。參試普通白菜自交系Q161 和Q195 均為武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所收集并經(jīng)多代自交選育獲得，其中Q161 薹莖亮綠、無明顯蠟質(zhì)，抽薹期早，薹莖較細(xì)，葉片較小，植株開展度較小，植株生長勢(shì)弱于有蠟質(zhì)材料；Q195薹莖有蠟質(zhì)、灰綠色，抽薹期晚，薹莖粗大，葉片較大，植株開展度較大。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 6 世代群體構(gòu)建及表型鑒定 2017 年8 月底在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)田播種Q161（P1）和Q195（P2）種子，12 月底定植于大棚，2018 年3 月雜交獲得F1種子；5 月對(duì)雙親及F1種子進(jìn)行催芽，并利用4 ℃冰箱低溫春化15 d，春化完成后播種于加代溫室，待植株開花后利用F1自交并分別和雙親回交獲得F2、BC1P1、BC1P2群體；9 月將親本和各群體材料種子播于穴盤中，幼苗3～5 片真葉時(shí)定植于露地，2019 年3 月植株經(jīng)過低溫春化后抽薹，薹莖高度50 cm 左右時(shí)進(jìn)行表型鑒定，記錄各群體中有、無蠟質(zhì)植株數(shù)，采用Excel 軟件進(jìn)行卡方測(cè)驗(yàn)。

1.2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和Qsep400TM分析采用CTAB 法（Murray & Thompson，1980）提取植株幼嫩葉片DNA，濃度稀釋到40～50 ng·μL-1備用。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：DNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，PCR Mix 8 μL，ddH2O 8 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過Qsep400TM核酸蛋白分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 BSA-seq 分析 在F2群體中挑選24 株薹莖亮綠單株和24 株薹莖有蠟質(zhì)單株，分別提取DNA并通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 的純度和完整性，采用Qubit 熒光計(jì)對(duì)DNA 濃度進(jìn)行精確定量，檢測(cè)合格的DNA 樣品備用。將稀釋后的24 株薹莖亮綠單株DNA 等量混合構(gòu)建混池1，24 株薹莖有蠟質(zhì)單株DNA 等量混合構(gòu)建混池2。同時(shí)提取雙親DNA，質(zhì)檢合格后備用。利用Illumina HiSeqTMPE150 對(duì)2 個(gè)子代池進(jìn)行基因組30×重測(cè)序，對(duì)2個(gè)親本進(jìn)行基因組20×重測(cè)序。參考基因組選擇白菜基因組Brapa_genome_v3.0（http：//brassicadb.org/brad/datasets/pub/Genomes/Brassica_rapa/V3.0/），大小為353 140 194 bp。將測(cè)序所得數(shù)據(jù)與白菜基因組進(jìn)行比對(duì)，分析測(cè)序深度及覆蓋度，數(shù)據(jù)質(zhì)量和比對(duì)均合格后用于后續(xù)分析。選擇親本重測(cè)序數(shù)據(jù)作為參考，分析2 個(gè)混池在親本間的SNP 和InDel頻率并預(yù)測(cè)候選區(qū)間。

1.2.4 InDel 標(biāo)記開發(fā) 利用普通白菜參考基因組作為“橋梁”，結(jié)合雙親的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析雙親之間的InDel 差異；根據(jù)親本的InDel 信息，提取InDel 上下游各100 bp 的序列，并根據(jù)上下游序列設(shè)計(jì)引物，引物的TM 值在55 ℃左右，長度18～22 bp。最后通過Blast 比對(duì)，篩選特異擴(kuò)增的多態(tài)性InDel 標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通白菜薹莖亮綠性狀的遺傳規(guī)律分析

2019年3月，在植株抽薹期對(duì)F1、F2、BC1P1、BC1P2群體進(jìn)行薹莖亮綠和有蠟質(zhì)性狀調(diào)查。其中，F(xiàn)1共4 株，薹莖均有蠟質(zhì)；F2共328株，薹莖有蠟質(zhì)植株256 株，薹莖亮綠植株72 株，分離比例為3.56∶1，經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合3∶1（χ2=1.47 ＜=3.84）；BC1P1共71 株，薹莖有蠟質(zhì)植株41株，薹莖亮綠植株30株，分離比例為1.37∶1，經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合1∶1（χ2=1.41 ＜=3.84）；BC1P2共72 株，薹莖均有蠟質(zhì)（表1）。推測(cè)普通白菜薹莖亮綠性狀由1 對(duì)隱性基因控制。

表1 普通白菜薹莖亮綠性狀的遺傳分析

2.2 BSA-seq 分析及候選區(qū)間預(yù)測(cè)

通過基因組重測(cè)序技術(shù)共產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)62.545 Gb，過濾后的有效數(shù)據(jù)為62.431 Gb，各樣本的原始數(shù)據(jù)量在12～20 Gb 之間，測(cè)序質(zhì)量高（Q20 ≥95.72%、Q30 ≥89.54%），GC 含量在38.59%～38.72%之間。4 個(gè)樣本的比對(duì)率在96.93%～97.71%之間，對(duì)參考基因組（排除N 區(qū)）的平均覆蓋深度在29.35×～47.74×之間，1×覆蓋度（至少有1 個(gè)堿基的覆蓋）在90.70%以上?；诨蚍中偷慕Y(jié)果，在2 個(gè)親本間共篩選出910 350 個(gè)多態(tài)性SNP 位點(diǎn)和243 311 個(gè)多態(tài)性InDel 位點(diǎn)。分析2 個(gè)混池的InDel 頻率差異分布，將A09 染色體的末端作為候選區(qū)間（圖1）。同時(shí)根據(jù)子代和親本的SNP 和InDel 頻率比較，結(jié)合ANNOVAR 注釋信息共篩選到101個(gè)候選SNP位點(diǎn)和56 個(gè)候選InDel 位點(diǎn)，位于A09 染色體的44.1～45.0 Mb 區(qū)間。

圖1 2 個(gè)混池的InDel 頻率差異在染色體上的分布

2.3 基因定位結(jié)果驗(yàn)證

在A09 染色體的末端30～45 Mb 區(qū)間開發(fā)設(shè)計(jì)116 對(duì)InDel 引物，利用這116 對(duì)InDel 引物對(duì)親本和F2單株極端混池進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并通過Qsep400TM檢測(cè)篩選到特異性引物Br100、Br112、Br116（表2、圖2）。在F2群體中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這3 對(duì)引物擴(kuò)增片段的基因型和表型共分離（圖2）。利用這3 對(duì)引物對(duì)BC1P1的30 株薹莖亮綠單株和F2的72 株薹莖亮綠單株進(jìn)行檢測(cè)，在Br100 上篩選到20 個(gè)重組單株，在Br112 上篩選到4 個(gè)重組單株，在Br116 上篩選到1 個(gè)重組單株，Br100和Br112 在目的基因的同側(cè)（圖3）。在Br112 和Br116 染色體區(qū)段內(nèi)繼續(xù)設(shè)計(jì)合成18 對(duì)引物，通過對(duì)雙親和混池的PCR 擴(kuò)增篩選到3 對(duì)較好的特異性引物Br117、Br119、Br134（表2、圖4），利用這3 對(duì)引物對(duì)F2和BC1P1群體中的薹莖亮綠單株進(jìn)行檢測(cè)，在Br117 和Br119 上分別篩選到4 個(gè)重組單株和1 個(gè)重組單株（重組單株位于Br112 同側(cè)），Br134 未篩選到重組單株。綜上，初步將普通白菜薹莖亮綠基因定位在A09 染色體的標(biāo)記Br119和Br116 之間，2 個(gè)標(biāo)記間的物理距離為380 kb（圖3）。

圖2 引物Br100、Br112、Br116 在雙親、極端混池及F2 群體中的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 普通白菜薹莖亮綠性狀基因定位物理圖譜

圖4 引物Br117、Br119、Br134 在雙親、極端混池中的擴(kuò)增結(jié)果

表2 6 對(duì)InDel 特異性引物及其序列

3 結(jié)論與討論

十字花科蕓薹屬作物中白菜類、結(jié)球甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、青花菜等均有關(guān)于蠟質(zhì)研究的報(bào)道。其中在青花菜、普通白菜、青梗菜、紅菜薹中發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)缺失性狀受1 對(duì)隱性基因控制（Anstey & Moore，1954；馮輝 等，2010；Zhang et al.，2013a；李紅蓮，2014）；在甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)缺失性狀受1 對(duì)顯性基因控制（Pu et al.，2013）；在結(jié)球甘藍(lán)中發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)缺失性狀有隱性遺傳（劉東明 等，2014；Tang et al.，2015；Liu et al.，2017b），也有顯性遺傳（Liu et al.，2017a）。上述研究表明蕓薹屬不同作物和同種作物的不同材料之間蠟質(zhì)性狀遺傳有所差異。本試驗(yàn)中，普通白菜自交系Q161 的薹莖亮綠蠟質(zhì)缺失性狀受1 對(duì)隱性基因控制，與曹陽等（2008）、Wang 等（2017）的研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)在明確普通白菜薹莖亮綠性狀遺傳規(guī)律的基礎(chǔ)上，利用BSA-seq 分析預(yù)測(cè)候選區(qū)間，并開發(fā)InDel 標(biāo)記驗(yàn)證候選區(qū)間，最終將薹莖亮綠基因定位在A09 染色體末端380 kb 的區(qū)間內(nèi)，與其最近的標(biāo)記分別為Br119 和Br116。根據(jù)白菜基因組注釋信息，定位區(qū)間內(nèi)有1 個(gè)與擬南芥蠟質(zhì)合成基因CER1同源的基因Bra032670（即BrCER1）。CER1基因主要在莖、花和果實(shí)的表皮中表達(dá)，CER1 蛋白包含鐵結(jié)合（富含組氨酸）結(jié)構(gòu)基元（Aarts et al.，1995），參與醛脫羧成烷烴的生物合成（Hannoufa et al.，1993）。Wang 等（2017）利用同源克隆方法克隆普通白菜的BrCER1基因，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在無蠟質(zhì)突變體13S126 中Brcer1基因發(fā)生1 個(gè)39 bp 的缺失，引起mRNA 轉(zhuǎn)錄錯(cuò)亂，進(jìn)而導(dǎo)致BrCER1基因的表達(dá)量在13S126 中下降。孫紅等（2017）通過RT-PCR 對(duì)大白菜蠟粉合成基因進(jìn)行分析，也初步證實(shí)了基因Bra032670與大白菜葉片表皮蠟粉合成有關(guān)。在結(jié)球甘藍(lán)中，控制無蠟質(zhì)性狀的Cgl1基因（CER1同源基因）在第1 個(gè)內(nèi)含子上有1 個(gè)2 722 bp 的插入，導(dǎo)致Cgl1起始密碼子發(fā)生移位（Liu et al.，2017a）。Pu 等（2013）在研究甘藍(lán)型油菜的無蠟質(zhì)基因BnA.GL時(shí)，將BnA.GL基因定位在9 號(hào)染色體末端，但對(duì)定位區(qū)間內(nèi)BnCER1基因（CER1同源基因）克隆時(shí)發(fā)現(xiàn)野生型和突變體材料之間該基因序列沒有明顯差異，僅在第5 個(gè)內(nèi)含子內(nèi)部有3 個(gè)SNP 的差異，基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)在無蠟質(zhì)親本中BnCER1基因的表達(dá)量下降?？偨Y(jié)前人研究發(fā)現(xiàn)，CER1的同源基因是蕓薹屬作物中參與蠟質(zhì)合成的重要基因，但在不同作物中該基因變異位點(diǎn)差異很大，可能和物種基因進(jìn)化及突變有關(guān)。這些結(jié)果為研究蕓薹屬作物的蠟質(zhì)基因和功能分析代謝提供了一定的理論研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為相關(guān)作物育種提供了應(yīng)用研究基礎(chǔ)。