劉展眉，張漢輝，東方云，肖裕澤，程杏安，蔣旭紅*

（1.廣州南洋理工職業(yè)學(xué)院教學(xué)科研部，廣東 廣州 510900；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 廣州 510225）

黃酮類化合物是天然產(chǎn)物中富有活性的植物成分，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域均有重要的意義。木犀草素是一種具有代表性的天然黃酮類化合物[1]，具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗腫瘤[4]以及保護(hù)心血管[5]等多種生物活性?；ㄉ鷼な悄鞠菟氐淖钪匾獊碓粗籟6]。目前木犀草素的分離純化主要采用有機(jī)溶劑提取[7]、硅膠柱層析[8]或大孔吸附樹脂吸附[9]等，但由于植物中活性成分種類多樣，結(jié)構(gòu)相似，所以存在著分離效果差、溶劑消耗量多以及操作繁瑣等缺點(diǎn)，利用傳統(tǒng)的分離純化技術(shù)得到高純度的目標(biāo)分子存在較大難度[10-11]。因此研究和開發(fā)木犀草素的高效分離純化技術(shù)具有重要的意義。

分子印跡固相萃取技術(shù)是利用分子印跡聚合物作為固相萃取劑，選擇性分離目標(biāo)物的技術(shù)[12]。相較于傳統(tǒng)的固相萃取，分子印跡固相萃取對目標(biāo)化合物具有特異選擇性，能分離復(fù)雜樣品中的特定成分，并且具有較強(qiáng)的富集能力，檢測靈敏度高[13]。因此分子印跡-固相萃取現(xiàn)已成為分離純化的熱點(diǎn)之一，有著廣泛的應(yīng)用前景[14-16]。高文姬[17]、肖淑娟等[18]采用本體聚合法制備木犀草素分子印跡聚合物，并以其為填料制備分子印跡固相萃取柱，從花生殼提取物中分離純化了木犀草素。本體聚合法制備的分子印跡聚合物存在模板分子除去困難、在研磨過程中容易破壞位點(diǎn)、印跡位點(diǎn)效率低等缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了分離柱效及選擇性[19]，而采用沉淀聚合法制備分子印跡聚合物則不需研磨，顆粒大小較均勻，并且具有更多的均一識(shí)別位點(diǎn)[20-21]。

本研究以木犀草素為模板分子，α-甲基丙烯酸（α-methyl acrylic acid，MAA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）為交聯(lián)劑，采用沉淀聚合法制備木犀草素分子印跡聚合物；并以其為固相萃取柱填料，制備分子印跡固相萃取柱，研究萃取柱對木犀草素的萃取性能，為花生殼中木犀草素的提純提供了一種高效的分離方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木犀草素（純度97.81%）：上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；花生根莖：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院種子科學(xué)與工程研究所培育；α-甲基丙烯酸（MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、偶氮二異丁腈（azobisisobutyronitrile，AIBN）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-82水浴恒溫振蕩器：金壇市榮華儀器制造有限公司；HH-14數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；KH-45A電熱恒溫干燥箱：康恒儀器有限公司；ATY124電子天平：日本島津公司；Agilent-1200S高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；Visiprep DL SPE真空固相萃取裝置：美國Supelco公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分子印跡聚合物的制備

以木犀草素為模板分子，MAA為功能單體，按1∶8質(zhì)量比溶解于30 mL甲醇溶液中，加入6 mmol交聯(lián)劑EGDMA、100.0 mg引發(fā)劑AIBN到該混合溶劑中，超聲脫氣5 min，通氮?dú)? min脫氧，密封后于60℃恒溫水浴中聚合24 h。所得固體以甲醇-乙酸溶液（8∶2，體積比）為溶劑進(jìn)行索氏提取洗脫，直至洗脫液不含模板分子為止，再用甲醇反復(fù)洗滌聚合物除去殘留乙酸，真空干燥，得分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）。非分子印跡聚合物的制備除不加入木犀草素模板分子外，步驟與處理方法均與上述制備過程相同，得非分子印跡聚合物（non-imprinted polymers，NIPs）。

1.3.2 高效液相色譜條件（high performance liquid chroma-tography，HPLC）

色譜柱型號：CNW Athena C18-WP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（30∶70，體積比），柱溫：28℃，流速：1.0 mL/min，紫外檢測波長：350 nm，進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.3 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制1.0 mg/mL木犀草素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，甲醇稀釋，制備 2、4、8、12、16、20、28、40 μg/mL 的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.3.2高效液相色譜條件測定峰面積，繪制木犀草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 木犀草素分子印跡聚合物的吸附性能

1.3.4.1 分子印跡聚合物的動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取30.0 mg MIPs于20 mL具塞錐形瓶中，加入10 mL 1.0 mmol/L的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)液，置于25℃恒溫水浴中振蕩，每隔一段時(shí)間（0.5、2、4、5、6、8 h），取出MIPs上清液，通過HPLC測定其中木犀草素的含量，繪制木犀草素吸附量Q（μmol/g）與吸附時(shí)間（h）之間的變化曲線。其中吸附量Q按下式（1）進(jìn)行計(jì)算。

式中：Q為吸附量，μmol/g；Co為底物的初始濃度，μmol/mL；Ce為平衡后底物的濃度，μmol/mL；V 為吸附溶液的體積，mL；m為吸附劑印跡聚合物微球的質(zhì)量，g。

1.3.4.2 分子印跡聚合物的選擇性考察

分別稱取30.0 mg MIPs與NIPs置于20 mL具塞錐形瓶中，加入10 mL 1.0 mmol/L的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)液，置于25℃恒溫水浴中振蕩吸附8 h，取上清液，利用HPLC檢測木犀草素的含量，參照袁波的方法[22]，印跡因子IF按下式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：IF為印跡因子；QMIPs為分子印跡聚合物對木犀草素的吸附量，μmol/g；QNIPs為非分子印跡聚合物對木犀草素的吸附量，μmol/g。

1.3.5 花生殼提取物的制備

稱取花生殼粉末8.0 g，加入160 mL乙醇-水溶液（8∶2，體積比），置于80℃恒溫水浴中萃取3 h，將得到的乙醇提取液旋蒸至近干得花生殼提取液，自然干燥得花生殼乙醇提取物，密封放入干燥器中備用。

1.3.6 分子印跡固相萃取柱的制備

在固相萃取柱（solid phase extraction，SPE）中通過干法分別裝入約0.3 g MIPs與NIPs填料，確保填料緊實(shí)平整，再加入少許石英砂于MIPs上方固定。裝柱完畢后，加入10 mL甲醇潤濕柱子。取2 mL花生殼提取液溶解于不同體積比的甲醇-水溶液后，裝入固相萃取柱，以不同體積比的甲醇-水溶液進(jìn)行淋洗除去雜質(zhì)，真空抽干，以25 mL不同種類的甲醇-酸溶液進(jìn)行洗脫，收集淋洗液及洗脫液，HPLC檢測其中木犀草素的含量，木犀草素在固相萃取柱中的保留率A、洗脫率B 按下式（3）、（4）進(jìn)行計(jì)算。

式中：A為木犀草素的保留率，%；m0為上樣液中木犀草素的質(zhì)量，μg；m1為流出液中木犀草素的質(zhì)量，μg。

式中：B為木犀草素洗脫率，%；m0為上樣液中木犀草素的質(zhì)量，μg；m1為洗脫液中木犀草素的質(zhì)量，μg。

2 結(jié)果與分析

2.1 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)木犀草素的濃度C（μg/mL）與色譜圖峰面積A（mAU）之間的對應(yīng)關(guān)系，建立線性方程，繪制相對的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=72.026x+19.419，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of luteolin

2.2 分子印跡聚合物制備條件的優(yōu)化

2.2.1 模板分子與功能單體的摩爾比選擇

以木犀草素為模板分子，α-甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，固定交聯(lián)劑EGDMA用量為5 mmol/L，引發(fā)劑AIBN用量為100.0 mg，分別以不同摩爾比的木犀草素與 MAA（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）制備 MIPs，考察模板分子與功能單體的摩爾比對MIPs吸附量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 模板分子與功能單體的摩爾比對MIPs吸附量的影響Fig.2 Effect of the molar ratio of template to monomer on MIPs adsorption capacity

由圖2可知，隨著MAA用量的增加，MIPs的吸附量逐漸增加，當(dāng)木犀草素與MAA的摩爾比為1∶8時(shí)，MIPs的吸附量達(dá)到最大值32.22 μmol/g，而隨著MAA用量的繼續(xù)增加，MIPs的吸附量逐漸減少。這是因?yàn)楫?dāng)功能單體MAA用量較少時(shí)，只有少量的木犀草素能與功能單體結(jié)合形成復(fù)合物，還有大量未結(jié)合的印跡分子存在，制備的MIPs中只有較少的木犀草素選擇性吸附位點(diǎn)，導(dǎo)致吸附量較少；而隨著MAA用量的增加，木犀草素與MAA間形成更多的選擇性吸附位點(diǎn)，吸附量逐漸增加，但MAA用量過多時(shí)，過量的MAA會(huì)導(dǎo)致非選擇性的結(jié)合位點(diǎn)增加，還會(huì)引發(fā)自身分子的聚合，導(dǎo)致MIPs中木犀草素的吸附位點(diǎn)減少，吸附量減少。因此，木犀草素與MAA的最佳摩爾比為1∶8。

2.2.2 交聯(lián)劑用量的選擇

固定木犀草素與MAA的摩爾比為1∶8，引發(fā)劑AIBN用量為100.0 mg，分別以不同用量的交聯(lián)劑EGDMA（2、4、6、8、10 mmol）制備 MIPs，考察交聯(lián)劑用量對MIPs吸附量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 交聯(lián)劑用量對MIPs吸附量的影響Fig.3 Effect of the cross-linker dosage on MIPs adsorption capacity

由圖3可知，隨著交聯(lián)劑EGDMA用量的增加，MIPs的吸附量逐漸增加，當(dāng)交聯(lián)劑EGDMA的用量為6 mmol時(shí)，MIPs的吸附量達(dá)到最大值42.56 μmol/g，而隨著EGDMA用量的繼續(xù)增加，MIPs的吸附量逐漸減少。這是因?yàn)楫?dāng)交聯(lián)劑EGDMA用量較少時(shí)，低交聯(lián)劑用量會(huì)使MIPs的印跡空穴剛性過低，洗脫后難以維持空穴原來的形狀和大小，導(dǎo)致木犀草素的識(shí)別效果不佳，吸附量較少；而隨著EGDMA用量的增加，MIPs的印跡空穴剛性增強(qiáng)，減少聚合物在不同溶劑中的溶脹，但當(dāng)EGDMA的用量過多時(shí)，木犀草素在聚合物體系內(nèi)的傳質(zhì)會(huì)被高度交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)阻斷，導(dǎo)致分離效果下降，吸附量減少。因此，交聯(lián)劑EGDMA的最佳用量為6 mmol。

2.3 木犀草素分子印跡聚合物的吸附性能

2.3.1 分子印跡聚合物的動(dòng)態(tài)吸附性能

用動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)考察聚合物MIPs的吸附性能，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線，結(jié)果如圖4。

圖4 MIPs動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.4 Dynamic adsorption curve of MIPs

由圖4可知，MIPs在前5 h內(nèi)吸附量先迅速增大，后緩慢上升，在5 h時(shí)MIPs達(dá)到最大吸附量37.22 μmol/g，而5 h后，吸附量出現(xiàn)先下降后上升的現(xiàn)象。這是由于在吸附的初期，MIPs的結(jié)合位點(diǎn)未達(dá)到飽和狀態(tài)，吸附量隨著吸附時(shí)間的增加而迅速上升；當(dāng)吸附量增大到一定程度時(shí)，溶液中木犀草素的濃度降低，MIPs出現(xiàn)外吐現(xiàn)象，使得吸附量降低，降低到一定程度時(shí)MIPs又重新開始吸附木犀草素。因此，MIPs在5 h時(shí)吸附量最大且基本達(dá)到吸附平衡。

2.3.2 分子印跡聚合物選擇性吸附性能

試驗(yàn)結(jié)果表明，在1.0 mmol/L的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)液中，MIPs的吸附量可達(dá)44.75 μmol/g，而NIPs的吸附量僅有 36.38 μmol/g，印跡因子按式（2）進(jìn)行計(jì)算，得IF=1.23。MIPs比NIPs具有更強(qiáng)的選擇吸附性，這是由于NIPs在合成的過程中并沒有加入相應(yīng)的模板分子，無法形成具有特異性吸附的空穴，所以NIPs的吸附主要是物理吸附作用，而合成的MIPs除了具有物理吸附外，還有特異性吸附，因此它的吸附量較NIPs高。

2.4 分子印跡-固相萃取條件的優(yōu)化

2.4.1 上樣溶劑的選擇

由于木犀草素在甲醇溶液中溶解性較好，同時(shí)花生殼中木犀草素的提取以甲醇-水溶液為溶劑，因此試驗(yàn)分別以不同體積比的甲醇-水溶液（0∶100、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、100∶0）作為上樣溶劑，考察其對木犀草素保留率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 上樣溶劑對木犀草素保留率的影響Fig.5 Effect of sample solvent on luteolin retention rate

由圖5可知，隨著溶劑中甲醇含量的增加，木犀草素的保留率逐漸下降。當(dāng)采用純水作為上樣溶劑時(shí)，木犀草素的保留率達(dá)到最高84.63%，而采用純甲醇作為上樣溶劑時(shí)，木犀草素的保留率達(dá)到最低56.06%。這是由于木犀草素在甲醇中溶解度較大，當(dāng)上樣溶劑中甲醇濃度較高時(shí)，木犀草素容易隨著上樣液流出萃取柱，造成樣品的損失，保留率下降；而甲醇濃度過低時(shí)，則溶劑極性過大，容易影響聚合物中印跡空穴與木犀草素物質(zhì)間的氫鍵作用[23]；且甲醇濃度過低不利于粗提取物的溶解，造成上樣過程中部分提取物析出，進(jìn)行淋洗時(shí)，容易隨著淋洗液流出，影響萃取效果。故選用甲醇-水溶液（50∶50，體積比）作為上樣溶劑。

2.4.2 淋洗液的選擇

試驗(yàn)以10 mL不同體積比的甲醇-水溶液（10∶90、20∶80、30∶70、35∶65、40∶60、50∶50）作為淋洗液，考察其對木犀草素保留率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 淋洗液對木犀草素保留率的影響Fig.6 Effect of abluent solvent on luteolin retention rate

由圖6可知，隨著甲醇含量的增加，木犀草素的保留率呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)采用甲醇-水溶液（10∶90，體積比）作為淋洗液時(shí)，木犀草素的保留率達(dá)到最高98.11%，當(dāng)采用甲醇-水溶液（50∶50，體積比）時(shí)，保留率達(dá)到最低39.08%。且當(dāng)甲醇體積占比大于35%時(shí)，木犀草素的保留率快速下降，這是由于甲醇含量的增加，使木犀草素在淋洗液中的溶解度大幅上升，容易隨著雜質(zhì)一起流出，造成保留率驟減。而甲醇-水體積比處于 10∶90～35∶65 時(shí)，木犀草素的保留率為 98.11%～90.24%，相對影響較小，因此選用甲醇-水溶液（35∶65，體積比）作為淋洗液。

2.4.3 淋洗液用量的選擇

試驗(yàn)以 5、10、15、20、25 mL 的甲醇-水溶液（35∶65，體積比）作為淋洗液，考察其對木犀草素保留率的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 淋洗液用量對木犀草素保留率的影響Fig.7 Effect of dosage of abluent solvent on luteolin retention rate

由圖7可知，隨著淋洗液用量的增加，木犀草素的保留率呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)淋洗液用量為5 mL時(shí)，木犀草素保留率達(dá)到最高99.00%，而當(dāng)淋洗液用量為25 mL時(shí)，保留率達(dá)到最低74.25%。淋洗液用量在5 mL～15 mL時(shí)，大部分雜質(zhì)以及少量木犀草素隨淋洗液流出，而當(dāng)淋洗液用量為15 mL～25 mL時(shí)，大量木犀草素開始溶解于淋洗液中，隨著淋洗液流出，造成保留率的下降。但是淋洗液用量過低易造成雜質(zhì)殘留。因此選用15 mL的甲醇-水溶液（35∶65，體積比）作為最佳淋洗液。

2.4.4 洗脫液的優(yōu)化

試驗(yàn)分別選取25 mL甲醇-乙酸溶液（80∶20，體積比）、甲醇-甲酸溶液（80∶20，體積比）、甲醇-乙酸溶液（90∶10，體積比）、純甲醇溶液作為洗脫液，考察其對木犀草素洗脫率的影響，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，當(dāng)采用純甲醇作為洗脫液時(shí)，木犀草素的洗脫率達(dá)到最低67.76%，當(dāng)采用體積比80∶20的甲醇-甲酸溶液作為洗脫液時(shí)，洗脫率達(dá)到最高85.57%。這是由于MIPs主要通過氫鍵作用吸附木犀草素，在保持相同洗脫劑用量的前提下，加入少量的有機(jī)酸易于破壞木犀草素與MIPs間的氫鍵作用，洗脫率上升。甲酸的酸性比乙酸強(qiáng)，所以80%甲醇-甲酸洗脫率最高，因此選用25 mL的體積比80∶20的甲醇-甲酸溶液作為最佳洗脫液。

2.5 花生殼提取物中木犀草素分子印跡-固相萃取純化

按照1.3.2的HPLC條件對花生殼提取物上樣液、固相萃取淋洗液以及洗脫液進(jìn)行檢測，木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品、花生殼提取物上樣液、固相萃取淋洗液以及洗脫液的HPLC色譜圖見圖9。液相色譜的分析結(jié)果見表1。

圖9 HPLC色譜圖Fig.9 The HPLC figure

表1 液相色譜的分析結(jié)果Table 1 Analysis results of HPLC

由圖9、表1可知，木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品的平均保留時(shí)間是（15.838±0.154）min；花生殼提取物上樣液中木犀草素的平均保留時(shí)間是（15.597±0.126）min，除此之外還存在大量雜質(zhì)峰；固相萃取洗脫液中木犀草素的平均保留時(shí)間是（15.779±0.029）min，雜峰顯著減少。固相萃取淋洗液在保留時(shí)間15 min～16 min無木犀草素的特征峰出現(xiàn)，只存在大量雜峰，說明固相萃取的淋洗液可較好地除去雜質(zhì)?；ㄉ鷼ぬ崛∥锷蠘右褐心鞠菟氐姆迕娣e占總面積51.99%，經(jīng)分子印跡-固相萃取分離純化后，木犀草素的峰面積占總面積94.18%，提高了42.19%。

3 結(jié)論

采用沉淀聚合法制備了木犀草素分子印跡聚合物，該印跡聚合物對木犀草素具有優(yōu)良的吸附效果以及選擇性。以其為填料制備了木犀草素分子印跡固相萃取柱，確定了固相萃取柱的最優(yōu)上樣溶劑為甲醇-水溶液（50∶50，體積比）、淋洗液為甲醇-水溶液（35∶65，體積比）、洗脫液為體積比80∶20的甲醇-甲酸溶液，用此固相萃取柱對花生殼提取物中的木犀草素進(jìn)行分離純化，該固相萃取柱對木犀草素表現(xiàn)出較好的選擇性吸附效果，可分離純化出相對純度為94.18%的木犀草素，為花生殼中木犀草素的分離純化提供了一種高效的分離方法。