苑鳳婷，孫 斌

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

細胞核DNA 是相對穩(wěn)定的遺傳活性物質(zhì)，在生物體細胞核中具有恒定性和保守性的特點[1]。在動物死后一段時間，細胞核DNA 會發(fā)生降解、減少，直至消失[2]。本實驗以斷頸處死的31日齡雛麻雞為實驗動物模型，采取腦組織，提取DNA 做瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)電泳圖譜，觀察禽死后腦組織DNA變化的規(guī)律與特征。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康雛麻雞6 只，31日齡，雌雄不限，實驗動物均為大慶市讓胡路區(qū)某養(yǎng)殖場提供。

1.1.2 主要試劑

PBS 液、液氮、裂解液、緩沖液GA、緩沖液GB、緩沖液GD、RNaseA 溶液、蛋白酶K、無水乙醇、漂洗液PW、洗脫緩沖液TE、吸附柱CB3、收集管、5×TBE 電泳緩沖液、6×電泳載樣緩沖液、溴化乙錠(EB)溶液母液、瓊脂糖、橡皮膏。

1.1.3 主要器材

平皿、常規(guī)解剖器械、眼科剪、恒溫箱、濾紙、研缽、EP 管、離心機、錐形瓶、微波爐、樣品梳子、移液器、水平電泳槽、水浴鍋、凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 取材

將13 只雛麻雞適應(yīng)性飼養(yǎng)12 天，同時斷頸處死，置室溫為14.5℃有暖氣的解剖室。

取材部位：全腦組織

取材方法：于雛麻雞處死后立即進行開顱取腦一次作為對照組（0 min），之后的12 個對照組（1 min、5 min、10 min、30 min、1 h、3 h、5 h、12 h、24 h、3 d、5 d、10 d）采取相同方法采取腦組織，每組1 只雛麻雞。

取材處理：取材依次編號放入無菌培養(yǎng)皿中置于-4℃的恒溫箱中，等待進行DNA 含量測定。

取材分組：同時間采集的一個樣品記錄為一組，共計組別為13 組。

1.2.2 腦組織研磨

稱取雛麻雞腦組織取材2.5 g，用冰PBS 液清洗去除血跡，濾紙吸干，放入已經(jīng)預(yù)先置于保溫箱內(nèi)的研缽中，保溫箱能盡量減少液氮的揮發(fā)使溫度恒定。用眼科剪剪碎組織后，開始研磨，邊研磨邊添加液氮（在液氮沒有揮發(fā)盡時添加）研磨成粉末，之后待液氮揮發(fā)盡立即加入裂解溶液，裂解液加入后組織懸液會凍成冰塊，繼續(xù)研磨直至融化成液態(tài)的懸液，此時研磨充分，將研磨的細胞懸液收集于EP 管內(nèi)，待用。

1.2.3 腦組織基因組DNA 提取

（1）將研磨好的細胞懸液倒入離心管中以10 000 rpm 時間1 min，棄除上清，放入緩沖液GA200 μL，振蕩法使其完全懸浮，添加RNaseA(100 mg/ml)溶液4 μL，振蕩15 s，靜置在室溫內(nèi)5 min，除RNA。

（2）滴加20 μL 蛋白酶K 溶液20 μL，充分混勻，56℃靜置，每20 min 顛倒混勻樣品1 次，組織溶解后，輕微離心使蓋內(nèi)壁水珠去除。

（3）滴加GB200 μL,混勻徹底，70℃10 min放置，溶液清亮，輕微離心使蓋內(nèi)壁水珠去除。

（4）滴加無水乙醇200 μL，振蕩15 s 混勻，輕微離心使蓋內(nèi)壁水珠去除。

（5）將第四步的絮狀沉淀以及溶液全加入吸附柱CB3 里，吸附柱置于收集管內(nèi),30 s,1 2000 rpm離心，棄廢液，取吸附柱CB3 放回收集管。

（6）加500 μL 緩沖液GD 在吸附柱CB3中,30 s,1 2000 rpm 離心，棄除廢液，取吸附柱CB3 放回收集管。

（7）加600 μL 漂洗液PW 于吸附柱CB3 中，30 s,1 2000 rpm 離心，棄除廢液，取吸附柱CB3放回收集管。

（8）重復(fù)上一步。

（9）2 分鐘1 2000 rpm 離心，棄除廢液。吸附柱CB3 室溫數(shù)分鐘，充分晾干吸附物中剩余漂洗液。

（10）把吸附柱CB3 置于干凈離心管內(nèi)，對吸附膜中間位置懸滴洗脫緩沖液TE50 ～200 μL，3 min 左右室溫靜置，2 min2 000 rpm 離心，收集溶液于離心管。

1.2.4 電泳及材料配置

1.2.4.1 0.5×TBE 稀釋緩沖液的配置

取5×TBE 緩沖液20 ml 加水至200 ml，配制成0.5×TBE 稀釋緩沖液，待用。

1.2.4.2 瓊脂糖凝膠液的制備

稱0.4 克瓊脂糖放入200 ml 錐形瓶，再倒入0.5×TBE 稀釋緩沖液50 ml，微波爐內(nèi)加熱直至瓊脂糖充分融化，取出搖勻備用。

1.2.4.3 瓊脂糖凝膠板的制備

使用橡皮膏充分封住有機玻璃膠槽兩端，插入樣品梳子，梳子齒下緣距膠槽底1 mm 左右。待瓊脂糖膠液溫度降至60℃左右時滴加溴化乙錠(EB)溶液使得終濃度為0.5 μg/ml。待瓊脂糖溶液凝固后將瓊脂糖倒入膠槽里，形成均勻膠層。待凝膠充分凝固后在不損壞底部的情況下取出梳子，加0.5×TBE 稀釋緩沖液于槽內(nèi)使得液面剛剛沒過膠板的表面。

1.2.4.4 加樣

取10 μLDNA 樣品與2 μL6×上樣液混勻，用微量移液槍小心地加入樣品槽中，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿，但總體積不可超過樣品槽容量。

1.2.4.5 電泳

加樣完成合上電泳槽蓋，立即接通電源。電壓保持在60 ～80 V，電流在40 mA 以上，待溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2 cm 時，停止電泳。

1.2.4.6 染色

未加EB 凝膠板在電泳完畢后移入0.5 μg/ml的EB 溶液中，室溫下染色20 ～25 min。

2 結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳顯示，各組條帶呈現(xiàn)連續(xù)的彌散型條帶，與預(yù)期結(jié)果相符合，用凝膠成像系統(tǒng)照像（見圖1）。

圖1 雛麻雞死后不同時間段DNA 的電泳條帶

M1：15 000 DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2：2 000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；

1：死后1 min；2：死后10 min；3：死后1 h；4：死后3 h；5：死后12 h；6：死后72 h

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，死后雛麻雞腦組織DNA 凝膠電泳呈現(xiàn)連續(xù)的彌散性條帶，說明雛雞死后腦組織中的DNA 在不斷連續(xù)的降解，圖像特征與壞死的DNA降解相似。說明正常死亡后細胞和壞死細胞降解相同，為隨機破壞，理由如下：凋亡細胞和壞死細胞在電泳后條帶有較大區(qū)別，處理后的凋亡細胞常規(guī)方法進行分離提純DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后，在凋亡細胞群里能觀察到典型的梯形電泳圖譜[3]。然而，細胞壞死過程中染色質(zhì)不會發(fā)生凝集現(xiàn)象，不會出現(xiàn)200 bp 的DNA 降解片段，而是被隨機降解，瓊脂糖凝膠電泳時呈現(xiàn)彌散性分布的現(xiàn)象，俗稱“拖尾”。由此可以實驗所得結(jié)論成立。

在本實驗中電泳圖譜的第三、第四條帶從時間上降解含量顯示不是很成功，但是毫不影響本實驗結(jié)論。希望在下一次實驗中能夠做到更好。

4 結(jié)論

通過瓊脂糖凝膠電泳實驗，觀察到條帶是彌散型連續(xù)性條帶，從而可以證明DNA 的降解是連續(xù)的，同時也能說明正常死亡組織和壞死組織降解過程相似。