楊 銘，于德偉，赫 慧，楊 明

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院·吉林 長春 130012)

人參棗仁顆粒是根據(jù)中醫(yī)對失眠的治療經(jīng)驗(yàn)及中藥的特點(diǎn)和組方規(guī)律，選取可用于保健食品的藥食兩用中藥材人參、酸棗仁、天麻等，配伍制成的保健食品。本研究依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》(2003 年版)相關(guān)內(nèi)容[1]，觀察其改善睡眠功能，并對相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為將人參棗仁顆粒開發(fā)成為改善睡眠功能保健食品提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 人參棗仁顆粒：由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院新藥研究開發(fā)中心化學(xué)室提供，批號：20180401，10 g/袋；臨用時用蒸餾水配制成每1 mL含生藥量為0.68、0.23、0.12 g濃度。

1.2 動物 健康成年ICR小鼠，SPF級，雌性，體質(zhì)量19～21 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：屏障環(huán)境動物觀察室，溫度：21～25 ℃，相對濕度：40%～70%。飼料均購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司，許可證號：京飼證(2018)06073。

1.3 試劑 小鼠谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羥色胺(5-HT) ELISA 試劑盒：購自長春晶美生物科技有限公司；戊巴比妥鈉、巴比妥鈉：Sigma公司。

1.4 儀器 FA2204B型電子天平(d=0.1 mg)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DT100型電子天平(d=0.1 g)：熟雙杰電子天平有限公司；T6 紫外可見分光光度計：北京普利生有限公司；TGL-16B 高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HC-3618R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；ST-360酶標(biāo)儀：上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；ZZ-6小鼠自主活動測試儀：成都泰盟科技有限公司。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分4 批進(jìn)行。每批48 只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分4組，每組12只。分別為空白對照組和人參棗仁顆粒高(10 g/kg)、中(3.3 g/kg)、低(1.7 g/kg)(分別相當(dāng)于成人每日用量的30、10、5 倍)3個劑量組；每日以蒸餾水配置不同濃度樣品，以20 mL/kg灌胃給藥，空白對照組予同體積蒸餾水。每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃30 d。

2.2 觀察指標(biāo)及測定方法

2.2.1 對小鼠直接睡眠和自主活動的影響 末次給藥后30 min，將小鼠放入小鼠自主活動儀內(nèi)適應(yīng) 5 min，記錄5 min 內(nèi)小鼠的自主活動次數(shù)；并觀察給藥1 h內(nèi)各組入睡動物數(shù)及睡眠時間。睡眠以翻正反射消失為指標(biāo)。

2.2.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn) 小鼠末次給藥30 min后，各組動物腹腔注射47.5 mg/kg戊巴比妥鈉，注射體積為10 mL/kg，以翻正反射消失為指標(biāo)，觀察記錄動物入睡時間和覺醒時間，計算睡眠時間。

2.2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn) 小鼠末次給藥30 min后，各組動物腹腔注射27.5 mg/kg戊巴比妥鈉，注射體積為10 mL/kg，動物置24～25 ℃安靜環(huán)境下，觀察動物以翻正反射消失達(dá)1 min以上為入睡動物，記錄每組30 min內(nèi)入睡動物數(shù)。

2.2.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn) 小鼠末次給藥20 min后，各組動物腹腔注射250 mg/kg巴比妥鈉，注射體積為20 mL/kg，觀察注射巴比妥鈉后，以翻正反射消失達(dá)1 min以上為入睡指標(biāo)，記錄動物入睡時間，計算睡眠潛伏期。

2.2.5 小鼠腦內(nèi)GABA、5-HT及Glu含量測定 2.2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠測試觀察完畢后，脫頸椎處死，冰浴開顱取全腦后，在冰平皿上分離大腦，用冰生理鹽水沖洗血液，濾紙拭干，大腦稱重后，加9倍量的冰生理鹽，4 ℃條件下勻漿，取漿液至 2 mL離心管中離心(3 000 r/min，15 min，4 ℃)，取上清液，按照試劑盒相關(guān)操作步驟測定樣品中GABA、5-HT、Glu的OD 值，并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式，計算樣品中GABA、5-HT、Glu的含量。

3 結(jié)果

3.1 人參棗仁顆粒對小鼠直接睡眠和自主活動的影響 給藥后，各劑量組未見睡眠動物，對直接睡眠無影響。高劑量組、中劑量組小鼠自主活動次數(shù)減少，與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠直接睡眠和自主活動的比較

3.2 人參棗仁顆粒對延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響 見表2。由表2可見，高劑量組和中劑量組均能明顯延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間，與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。低劑量雖能增加小鼠睡眠時間，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠 睡眠時間的比較

3.3 人參棗仁顆粒對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響 見表3。由表3可見，各劑量組睡眠動物增加，但與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠睡眠發(fā)生率比較

3.4 人參棗仁顆粒對小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響 見表4。由表4可見，高劑量組和中劑量組均能明顯縮短巴比妥鈉小鼠睡眠潛伏期，與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。低劑量雖能減少小鼠睡眠潛伏期，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期比較

3.5 人參棗仁顆粒對小鼠腦GABA、5-HT及Glu含量的影響 見表5。由表5可見，與空白對照組比較，高、中劑量組均能明顯升高小鼠腦內(nèi)GABA和5-HT含量，有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。各劑量組對Glu含量有一定的降低作用，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表5 各組小鼠腦組織GABA、5-HT及Glu含量比較

4 討論

人參棗仁顆粒，由人參、酸棗仁、天麻、龍眼肉、遠(yuǎn)志、茯苓組成。君藥人參，甘溫補(bǔ)益，補(bǔ)力雄厚，補(bǔ)脾養(yǎng)心，滋陰養(yǎng)血，善補(bǔ)一切氣血虧虛；心血足則神自安，心氣強(qiáng)則善思多智，故心脾兩虛、氣血不足之不寐即可除之。臣藥酸棗仁，養(yǎng)心安神，甘補(bǔ)酸收，既能補(bǔ)心養(yǎng)肝而寧心安神，又可收斂營陰而止虛煩，可用于心脾兩虛、神失所養(yǎng)的失眠、驚悸之癥，以助君藥安神之功。佐藥遠(yuǎn)志、茯苓、龍眼肉、天麻，遠(yuǎn)志辛散苦泄溫通，使心腎互濟(jì)而安神定志，肺宣痰化竅開神寧，故可安神益智，拂郁化痰，而痰消寐復(fù)；茯苓補(bǔ)益心脾，養(yǎng)心安神，以助君臣安神；龍眼肉甘潤平和，營養(yǎng)心脾，稱為營養(yǎng)之佳品，有補(bǔ)心脾、益氣血之功，對思慮過度，勞傷心脾而致失眠堪有良效；天麻可定驚息風(fēng)、鎮(zhèn)驚安神。諸藥合用補(bǔ)心脾、益氣血、神安寧、寐可復(fù)，共奏補(bǔ)脾養(yǎng)心，補(bǔ)血安神之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參對不同類型的神經(jīng)衰弱患者均有一定的治療作用，能消除失眠癥狀[2]；天麻能對中樞神經(jīng)有明顯的藥理作用，具有鎮(zhèn)靜、安眠作用[3-4]；酸棗仁有鎮(zhèn)靜、催眠藥理作用[5]。研究結(jié)果表明，與空白對照組比較，人參棗仁顆粒對動物無直接睡眠作用；能明顯減少小鼠自主活動次數(shù)，有鎮(zhèn)靜作用；能延長閾上劑量戊巴比妥鈉小鼠睡眠時間，縮短巴比妥鈉小鼠睡眠潛伏期；表明人參棗仁顆粒有改善睡眠作用明顯。

睡眠覺醒與很多神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān)，如乙酰膽堿、谷氨酸、GABA、食欲素、褪黑素、組胺、腺苷等。不同的神經(jīng)遞質(zhì)相互聯(lián)系，互相影響，共同維持著睡眠覺醒節(jié)律[6]。5-羥色胺(5-HT)是腦內(nèi)一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，對睡眠的調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用，腦內(nèi)5-HT水平的減少可引起失眠，腦內(nèi) 5-HT 濃度升高，會產(chǎn)生睡意[7]。GABA 作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其分解代謝產(chǎn)物γ-羥基丁酸(GHB)可通過作用細(xì)胞膜上的GHB特異性受體、GABA-B 受體或 5-羥色胺能神經(jīng)系統(tǒng)等途徑，發(fā)揮對中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性神經(jīng)元的抑制作用，進(jìn)而對機(jī)體產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠等效果[8]；或可影響失眠障礙患者晝夜節(jié)律，而改善睡眠[9]。Glu是大腦中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在覺醒時的神經(jīng)活動中起著基礎(chǔ)作用。一般認(rèn)為失眠的發(fā)生與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)抑制性氨基酸的興奮性下降和興奮性氨基酸的興奮性升高有關(guān)[10]。研究結(jié)果表明，人參棗仁顆粒能顯著升高小鼠腦中5-HT 與GABA濃度，對Glu影響不明顯。可能與處方中人參、酸棗仁的活性成分調(diào)節(jié)5-HT與GABA有關(guān)[11-12]。提示人參棗仁顆粒能通過增加腦中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和GABA含量，發(fā)揮鎮(zhèn)靜和改善睡眠作用。中藥作用機(jī)制具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，人參棗仁顆粒改善睡眠作用機(jī)制有待于通過神經(jīng)內(nèi)分泌、細(xì)胞因子、基因蛋白等領(lǐng)域進(jìn)一步深入探究。