張依輪，劉 娜，王立范，楊 馨，安 艷，李 倩，羅文佳

(1黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036；2懷遠(yuǎn)縣中醫(yī)院·安徽 懷遠(yuǎn) 233400；3蘇州工業(yè)園區(qū)金雞湖社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心·江蘇 蘇州 215000)

局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)是原發(fā)性腎小球疾病的一個(gè)較為常見的病理綜合征，以大量蛋白尿或腎病綜合征為主要臨床表現(xiàn)，以局灶節(jié)段性分布的腎小球硬化為主要病理特征，是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要原因之一[1]。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)由膠原蛋白、非膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖與氨基聚糖5類物質(zhì)組成，ECM的過度積聚是導(dǎo)致腎小球硬化的重要因素，在FSGS進(jìn)展的過程中扮演著著十分重要的角色[2]。

中藥在防治慢性腎臟病的過程中始終發(fā)揮著重要作用，其中水蛭性味咸苦平，入腎、膀胱經(jīng)，逐瘀通經(jīng)，破血而不傷新血，可以有效延緩慢性腎臟病進(jìn)展并緩解腎臟病患者高凝、易栓狀態(tài)。據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：水蛭含水蛭素、氨基酸、微量元素等成分，具有良好的抗凝、抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗纖維化、抗血栓以及抗腫瘤等作用[3]，不僅在防治心腦血管系統(tǒng)疾病、腫瘤、甲狀腺疾病以及骨傷科疾病中應(yīng)用廣泛[4]，還可以有效的治療慢性腎臟病。近年來，在中醫(yī)久病入絡(luò)理論和現(xiàn)代藥理學(xué)研究的佐證下，水蛭逐漸成為治療難治性慢性腎臟病的優(yōu)選藥物。且已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)水蛭能通過減輕ECM的積聚來延緩FSGS的發(fā)展進(jìn)程[5]。本研究擬觀察水蛭對FSGS大鼠TGF-β1及I型膠原表達(dá)的影響，探討其在ECM積聚以及FSGS病情進(jìn)展過程中的作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年雄性Wistar大鼠共52只，購自于長春億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司，體質(zhì)量：180～220 g，實(shí)驗(yàn)動物證號：SCXK-(吉)2016-0001，微生物控制等級：SPF 級。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 水蛭顆粒劑：由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1212081，規(guī)格：0.5 g/袋(有效成分與飲片3g等量)。

1.3 試劑與儀器 阿霉素：浙江海正藥業(yè)有限公司； I型膠原兔抗大鼠多克隆抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠二抗PV6001：由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。電子天平：由上海方瑞儀器有限公司；臺式低速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；超低溫冰箱：SANYO ULTRA LOW Japan；Motic3000顯微攝影系統(tǒng)：美國麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；2135型切片機(jī)：德國萊卡。

2 方法

2.1 動物模型制備、分組與給藥 52只Wistar大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)l 周，實(shí)驗(yàn)前先將大鼠置于代謝籠中留取尿液標(biāo)本，用尿蛋白試紙測定尿蛋白呈陰性后隨機(jī)分成3組：即正常組12 只、假手術(shù)組12 只和造模組28 只。造模[5]：10%水合氯醛麻醉大鼠并固定于操作臺上，腎區(qū)皮膚常規(guī)消毒，沿脊柱左側(cè)旁做一縱行切口，切開皮膚后逐層向深處分離對腎臟進(jìn)行充分的游離暴露，將大鼠腎臟拉到手術(shù)切口外，分離腎門處的脂肪組織使腎動靜脈充分顯露，取動脈夾鉗夾動靜脈，結(jié)扎后切除左腎，結(jié)扎確定無出血后，縫合切口并消毒，清理體表血跡以防后期飼養(yǎng)撕咬。術(shù)后第1～3天，青霉素4萬U/d腹腔注射。腎摘除術(shù)后第7天，阿霉素(4 mg/kg)尾靜脈注射。術(shù)后第14天，將成模28 只大鼠隨機(jī)均分為模型組和水蛭組，術(shù)后第35天，造模大鼠尾靜脈注射阿霉素(3 mg/kg)。假手術(shù)組大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，僅作脊柱旁縱行切口并剝離左腎的脂肪包膜，不行左腎摘除術(shù)，術(shù)后第14天，予等劑量生理鹽水經(jīng)尾靜脈進(jìn)行注射，術(shù)后第35天，再次進(jìn)行生理鹽水經(jīng)尾靜脈注射。正常組大鼠不作任何處理，正常進(jìn)行飼養(yǎng)。水蛭組于左腎摘除術(shù)后第14天開始，以水蛭[0.9 g/(kg·d)]進(jìn)行灌胃給藥，其余各組以等容積蒸餾水進(jìn)行灌胃，共灌胃8周。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 一般狀態(tài)

2.2.2 腎組織TGF-β1、I型膠原表達(dá)的免疫組化檢測 灌胃第4周、第8 周末，每組各隨機(jī)選出6只大鼠處死以進(jìn)行取材。將大鼠處死后立即進(jìn)行右腎摘除術(shù)，隨后切除大鼠腎臟的部分腎皮質(zhì)用于免疫組化檢驗(yàn)。將腎皮質(zhì)進(jìn)行固定(使用10%甲醛溶液)，采用PV二步法對腎組織I型膠原、TGF-β1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。 切片常規(guī)脫蠟和水化后于3%H2O2中孵育10 min，以PBS沖洗3 次，每次沖洗2 min；隨后進(jìn)行微波爐抗原修復(fù)：705-800W，95 ℃中央加熱2 次，每次加熱5 min；而后分別滴加工作濃度的第一、二抗體，并分別在濕盒內(nèi)進(jìn)行孵育30～60 min，DAB顯色5～10 min后用蒸餾水充分沖洗后以蘇木素淡染細(xì)胞核，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用Motic3000顯微攝影系統(tǒng)于400倍下攝片，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，以積分光密度(IOD)代表蛋白相對表達(dá)量。積分光密度(IOD)=陽性面積×平均光密度，每組隨機(jī)分析6個(gè)高倍鏡視野，取其均值代表該照片的相對表達(dá)量。染色結(jié)果細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性為黃色或黃棕色。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài) 實(shí)驗(yàn)過程中，模型組1只大鼠在尾靜脈進(jìn)行阿霉素注射后死亡。正常組、假手術(shù)組食量正常，皮毛光滑潤澤，活動狀態(tài)正常，精神良好，體質(zhì)量在正常范圍內(nèi)有所增長；模型組食量均減少，皮毛晦暗干枯無光澤，呆滯不喜動，體質(zhì)量有所減輕甚至低于正常體質(zhì)量范圍。與模型組比較，治療組皮毛光滑度稍佳，精神狀態(tài)及靈敏度稍佳，體質(zhì)量降低速度較慢。

3.2 各組大鼠腎組織TGF-β1免疫組化檢測結(jié)果 見表1，圖1。

表1 各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)的比較

圖1 各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)的免疫組化檢測(×400)

TGF-β1在腎組織中的表達(dá)主要集中在腎小球系膜區(qū)，陽性表達(dá)表現(xiàn)為黃褐色顆粒狀沉積，著色較深。各時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組與正常組TGF-β1表達(dá)均較弱；模型組TGF-β1表達(dá)與正常組相較明顯增強(qiáng),差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；水蛭組TGF-β1表達(dá)較之模型組均減弱，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.3 各組大鼠腎組織I型膠原表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果 I型膠原在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞上均有表達(dá)，陽性表達(dá)表現(xiàn)為黃褐色顆粒狀沉積，著色較深。假手術(shù)組與正常組I型膠原表達(dá)均較弱；模型組I型膠原表達(dá)較正常組明顯增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；水蛭組I型膠原表達(dá)較之模型組表達(dá)明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2，圖2。

圖2 各組大鼠腎組織I型膠原表達(dá)免疫組化檢測(×400)

表2 各組大鼠腎組織I型膠原表達(dá)的比較

4 討論

局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，而其重要的病理改變表現(xiàn)為ECM

的過度積聚，因此，抑制ECM的過度積聚為延緩FSGS病程進(jìn)展的關(guān)鍵一環(huán)[6]。TGF-β1作為ECM積聚的重要因素，具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)TGF-β1可以通過刺激成纖維細(xì)胞、腎小球細(xì)胞等促進(jìn)ECM合成。(2)TGF-β1通過抑制多種ECM降解酶的活性及刺激基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)和纖溶酶原激活物抑制劑的活性增加抑制ECM降解。(3)TGF-β1通過加強(qiáng)ECM受體如整聯(lián)蛋白的表達(dá)來增加細(xì)胞與ECM之間的相互作用[7]。I型膠原是ECM的重要組成成分，其蛋白的表達(dá)主要是通過各種生長因子以及細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)控，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β扮演著尤為重要的角色。在病理情況下，I型膠原調(diào)節(jié)路徑的改變會刺激膠原過度生成[8]；已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)I型膠原的合成、分泌增多和降解減少亦是ECM積聚及腎間質(zhì)纖維化的重要原因[9]。因此TGF-β1及I型膠原表達(dá)的調(diào)節(jié)在ECM積聚的過程中扮演了十分重要的角色。

ECM的過度積聚使毛細(xì)血管袢逐漸閉塞狹窄，加重腎小球硬化，最終促成FSGS這一難治性腎病的發(fā)生發(fā)展，此病理特點(diǎn)與中醫(yī)痰濕瘀毒郁滯腎絡(luò)而致癥瘕的病機(jī)特點(diǎn)十分契合，符合中醫(yī)“腎絡(luò)郁滯”“久病入絡(luò)”的理念，治療當(dāng)以活血化瘀通絡(luò)為主。而應(yīng)用普通的活血化瘀藥物往往很難取得良好的效果，唯有應(yīng)用“搜剔絡(luò)邪”之蟲類藥才能奏以奇效[10],且FSGS病程長而致正氣多有耗損，不可使用過于峻猛之藥損傷正氣，故選用水蛭最為恰當(dāng)。水蛭，俗稱螞蟥，性味咸苦平，入腎、膀胱經(jīng)，具有破血逐瘀通經(jīng)的功效。張錫純評價(jià)此藥“破瘀血而不傷新血，純系水之精華生成，于氣分絲毫無損，而血瘀默然于無形，真良藥也”[11]，國醫(yī)大師張琪教授在辨治FSGS時(shí)方中加入水蛭常奏以良效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，水蛭有抗凝、抑制血小板聚集、促纖溶、擴(kuò)血管、促進(jìn)血液循環(huán)、抗炎等作用，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對于腎臟可以起到很好的保護(hù)作用[12]。本文實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)：水蛭可能通過調(diào)節(jié)FSGS模型大鼠腎組織TGF-β1及I型膠原的表達(dá)來減輕ECM的積聚，從而延緩FSGS的進(jìn)展。