王保明 馬冬春 閔旭紅 陳曉宇 朱學(xué)應(yīng)

(安徽省胸科醫(yī)院 1胸外科，安徽 合肥 230022；2腫瘤放療科；3安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

中性粒細(xì)胞(PMN)是一類(lèi)重要的免疫細(xì)胞。在急性炎癥反應(yīng)中，PMN過(guò)趨化運(yùn)動(dòng)的方式被募集到感染或組織損傷部位，進(jìn)而通過(guò)吞噬、脫顆粒作用殺死病原體〔1〕。此外，PMN也被發(fā)現(xiàn)存在于多種癌癥的腫瘤微環(huán)境中，被稱(chēng)為腫瘤相關(guān)PMN(TANs)〔2〕，已有研究表明，TANs的在腫瘤發(fā)生中功能非常復(fù)雜，并受到多種細(xì)胞因子、信號(hào)通路的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中，不同亞群的TANs發(fā)揮的生理功能也不盡相同，有的TANs可以通過(guò)釋放蛋白酶和細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤的侵襲和腫瘤血管新生〔3,4〕，也有的TANs也發(fā)揮了抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用〔5,6〕。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見(jiàn)的肺部惡性腫瘤之一〔7〕。在NSCLC組織中，也發(fā)現(xiàn)了PMN的浸潤(rùn)〔8〕。然而，PMN浸潤(rùn)在PMN疾病進(jìn)展中的功能及其作用機(jī)制還缺少深入的研究。PMN間接接觸共培養(yǎng)法，即使用培養(yǎng)過(guò)PMN的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，能夠避免細(xì)胞直接接觸造成的干擾，是研究PMN分泌蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的常用方法〔9,10〕。本研究采用體外分離小鼠骨髓PMN條件培養(yǎng)基與PMN細(xì)胞系A(chǔ)549共培養(yǎng)，探究了PMN對(duì)A549細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1試劑和材料 主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 3000、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；人淋巴細(xì)胞分離液(Histopaque 1077/1119)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗(Anti)-微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3抗體、Anti-p62抗體、Anti-蛋白激酶B(AKT)抗體、Anti-磷酸化(p)-AKT抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Tech公司；Anti-p-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。主要材料：NSCLC細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；野生型C57BL/6小鼠購(gòu)自維通利華公司。

1.2分離小鼠骨髓PMN并獲取PMN條件培養(yǎng)基 引頸處死8周齡健康小鼠，取小鼠股骨和脛骨，剝離肌肉組織后放置在PBS中。剪去股骨和脛骨兩端，用PBS沖洗骨髓細(xì)胞，得到骨髓細(xì)胞懸液。使用密度梯度離心的方法，將骨髓細(xì)胞懸液放置在Histopaque-1077/1119密度梯度分離液上，室溫1 200 r/min離心30 min，分離得到的PMN用PBS洗1次，培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)基，1 200 r/min 離心10 min，取上清即為PMN條件培養(yǎng)基。

1.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將A549細(xì)胞消化并重懸得到細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl接種于96孔培養(yǎng)版中，實(shí)驗(yàn)組使用PMN條件培養(yǎng)基，對(duì)照組使用正常培養(yǎng)基(90% RMPI1640+10% FBS)。在指定時(shí)間點(diǎn)每空加入10 μl CCK-8溶液，放置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4 h，隨后用酶標(biāo)儀測(cè)度450 nm吸光值。

1.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 胰酶消化收集單細(xì)胞懸液，并用PBS清洗1次。加入 Annexin V 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取100 μl細(xì)胞懸液加入5 μl Annexin V-FITC，5 μl PI 染色液混勻，室溫避光放置15 min。隨后加入400 μl Annexin V結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 胰酶消化收集單細(xì)胞懸液，離心去除上清培養(yǎng)基后，加入200 μl細(xì)胞裂解液，放置于冰上裂解20 min。加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，100℃水浴加熱10 min，得到變性的蛋白質(zhì)樣品。蛋白樣品經(jīng)過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上經(jīng)脫脂奶粉封閉后，加入一抗稀釋液室溫孵育1 h，隨后加入辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗稀釋液室溫孵育45 min，最后加入顯色底物，使用凝膠成像儀拍攝發(fā)光信號(hào)。

1.6免疫熒光實(shí)驗(yàn) 貼壁培養(yǎng)的A549細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定10 min，用PBS清洗1次，加入0.1 % Triton X-100孵育10 min，再次用PBS清洗1次，加入2% 牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min。隨后用鼠源抗LC3抗體室溫孵育45 min，再用FITC耦聯(lián)的羊抗鼠IgG熒光二抗孵育30 min，用PBS清洗3次后，加入DAPI對(duì)核酸進(jìn)行染色標(biāo)記。最后使用正置熒光顯微鏡拍照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad Prism7.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PMN條件培養(yǎng)基抑制A549細(xì)胞增殖 實(shí)驗(yàn)組72 h時(shí)，A549細(xì)胞的增殖活性與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組A549細(xì)胞增殖活性

2.2PMN條件培養(yǎng)基促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組〔(6.21±1.20)%〕相比，實(shí)驗(yàn)組〔(10.84±2.47)%〕細(xì)胞凋亡水平顯著上升(t=2.92，P=0.043 2)。

2.3PMN條件培養(yǎng)基促進(jìn)A549細(xì)胞自噬活性 對(duì)照組中，LC3主要呈彌散狀分布在細(xì)胞質(zhì)中，較少呈現(xiàn)點(diǎn)狀定位，表明細(xì)胞自噬活性較弱，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，LC3大多出現(xiàn)點(diǎn)狀聚集定位，表明細(xì)胞自噬活性較高。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫熒光染色法檢測(cè)LC3蛋白(×1 000)

2.4PMN條件培養(yǎng)基抑制A549細(xì)胞AKT-mTOR信號(hào)通路 見(jiàn)圖2、表2。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)水平明顯上升，p-AKT的表達(dá)水平也明顯提升，p-mTOR的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，總AKT蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。

圖2 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKT-mTOR信號(hào)通路

表2 各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

PMN在NSCLC腫瘤組織中的浸潤(rùn)很早就被發(fā)現(xiàn)，但其對(duì)NSCLC疾病進(jìn)展的作用還不是很清楚〔8〕。韓露露等〔11〕發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜(DMSO)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化成的PMN樣細(xì)胞條件培養(yǎng)基會(huì)抑制NSCLC血管新生能力，但其對(duì)細(xì)胞活性的影響還沒(méi)有深入研究。本研究結(jié)果說(shuō)明PMN條件培養(yǎng)基可以抑制NSCLC細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。LC3是常用的檢測(cè)細(xì)胞自噬活性的標(biāo)記蛋白。在正常生理?xiàng)l件下，LC3定位在細(xì)胞質(zhì)中，稱(chēng)為胞質(zhì)型LC3(LC3-Ⅰ),在細(xì)胞自噬被激活后，LC3-Ⅰ能夠結(jié)合磷脂酰乙醇胺(PE)，轉(zhuǎn)變成為L(zhǎng)C3-Ⅱ，定位在自噬小體的膜上〔12〕。因此，A549細(xì)胞中LC3呈現(xiàn)點(diǎn)狀定位及LC3-Ⅱ水平升高均能表明PMN條件培養(yǎng)基促進(jìn)了細(xì)胞的自噬活性。

正常細(xì)胞通常會(huì)通過(guò)一定水平的自噬活性來(lái)清除蛋白和受損細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。腫瘤細(xì)胞中常常出現(xiàn)自噬被抑制，激活腫瘤細(xì)胞的自噬活性可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔13〕。在KRASG120D突變引起的NSCLC模型小鼠中，如果同時(shí)缺失自噬關(guān)鍵蛋白p62，腫瘤的生長(zhǎng)會(huì)被抑制〔14,15〕。然而，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)激活自噬也可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生〔13,16〕，這表明細(xì)胞自噬可能通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤細(xì)胞的自噬除了被細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控，同樣也受到缺氧、營(yíng)養(yǎng)不足及細(xì)胞外基質(zhì)等腫瘤微環(huán)境的影響。研究表明，免疫反應(yīng)產(chǎn)生的許多細(xì)胞因子如干擾素(IFN)-γ〔17〕、腫瘤壞死因子(TNF)-α〔18〕等促進(jìn)細(xì)胞的自噬活性，這些細(xì)胞因子對(duì)NSCLC細(xì)胞自噬活性的調(diào)控是通過(guò)活化核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)PMN條件培養(yǎng)基可以抑制A549細(xì)胞的AKT-mTOR信號(hào)通路。AKT-mTOR是調(diào)控細(xì)胞自噬反應(yīng)的重要信號(hào)通路，AKT的活性抑制會(huì)引起mTOR活性的下降，而mTOR可以直接調(diào)控自噬相關(guān)蛋白ATG13的磷酸化水平調(diào)控細(xì)胞自噬活性〔19〕。

腫瘤部位浸潤(rùn)的PMN也可以分泌多種細(xì)胞因子、活性氧和顆粒酶等，參與調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)〔20〕，然而具體是哪些細(xì)胞因子或蛋白促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的自噬和凋亡還需要進(jìn)一步的研究。