徐成陽 段紅艷 李明艷

(河南省人民醫(yī)院暨鄭州大學人民醫(yī)院國際醫(yī)療中心一病區(qū)，河南 鄭州 450003)

血糖變化引起的血管內皮受損是動脈粥樣硬化性病變的原因，而動脈粥樣硬化是糖尿病(DM)血管并發(fā)癥的病理基礎，DM血管并發(fā)癥可導致患者致死、致殘〔1，2〕。研究DM血管并發(fā)癥的發(fā)生機制，針對發(fā)病機制為靶點的治療有助于DM慢性并發(fā)癥的防治〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(lncRNA)與血管內皮細胞病理性增殖及脂代謝相關，在DM及其血管并發(fā)癥中具有重要作用〔4〕。核旁叢組裝轉錄本1(NEAT1)是一個非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)抑制NEAT1通過靶向miR-204和調節(jié)核轉錄因子(NF)-κB途徑減輕了脂多糖(LPS)誘導的細胞損傷〔5〕。上調NEAT1有助于神經(jīng)保護機制抵抗神經(jīng)元損傷〔6〕。沉默NEAT1可減弱血管平滑肌細胞增殖和遷移〔7〕。微小RNA(miRNA)參與調控DM及相關疾病〔8〕。miR-217通過調控SIRT1參與高糖誘導的內皮細胞凋亡〔9〕。過表達miR-217還可促進人皮膚成纖維細胞的衰老〔10〕。然而lncRNA NEAT1對高糖誘導血管內皮細胞的影響及其機制是否與miR-217有關還尚未清楚。本實驗旨在研究lncRNA NEAT1對高糖誘導血管內皮細胞的影響及其機制是否與miR-217有關。

1 材料與方法

1.1材料 人臍靜脈內皮細胞株EAhy926(上海細胞庫)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone)；Trizol試劑、熒光定量試劑盒(美國Progema)；RIPA蛋白裂解液(上海碧云天)；細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京Solarbio)；載體質粒(上海伯易生物)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組 EAhy926細胞常規(guī)培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中，用終濃度為25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h作為高糖(HG)組，正常培養(yǎng)的細胞作為對照(NG)組；將pcDNA、pcDNA-NEAT1、anti-miR-con、anti-miR-217轉染至高糖處理的EAhy926細胞中，計為HG+pcDNA組、HG+pcDNA-NEAT1組、HG+anti-miR-con組和HG+nti-miR-217組；將pcDNA-NEAT1與miR-con、miR-217分別共同轉染至高糖處理的EAhy926細胞中，記為HG+pcDNA-NEAT1+miR-con組、HG+pcDNA-NEAT1+miR-217組。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測miR-217和NEAT1的表達水平 提取總RNA，反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR，miR-217和NEAT1分別以U6和β-actin為內參，用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.2.3Western印跡檢測細胞周期素(Cyclin)D1、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3蛋白表達 提取細胞總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜后用5 %脫脂奶粉封閉，加入一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，顯影、定影，分析蛋白條帶的吸光度，β-actin為參照計算蛋白表達水平。

1.2.4CCK-8檢測細胞存活率 各組細胞培養(yǎng)48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃培養(yǎng)2 h。酶標儀上檢測490 nm波長的吸光度(OD)值。以NG為對照計算細胞存活率。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，漂洗后加入500 μl結合緩沖液重懸；然后分別加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻、避光孵育10 min；上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6熒光素酶報告基因檢測實驗檢測NEAT1對miR-217的靶向調控 將NEAT1野生型和突變型熒光素酶表達載體分別與miR-con和miR-217共轉染至EAhy926細胞，按照說明書進行檢測。將pcDNA、pcDNA-NEAT1、si-con、si-NEAT1分別轉染至正常EAhy926細胞中，用RT-qPCR檢測miR-217表達水平。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.00軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞中NEAT1和miR-217表達的影響 與NG組相比，HG組人臍靜脈內皮細胞中NEAT1表達水平顯著降低，miR-217表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 NEAT1和miR-217在高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞中表達

2.2過表達NEAT1和高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響 與NG組相比，HG組人臍靜脈內皮細胞中NEAT1、CyclinD1表達水平顯著降低，細胞存活率顯著降低(P<0.05)；與HG+pcDNA組相比，HG+pcDNA-NEAT1組NEAT1、CyclinD1表達水平顯著升高，細胞存活率顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2?？梢?，過表達NEAT1促進高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞增殖。

1～4：NG組、HG組、HG+pcDNA組、HG+pcDNA-NEAT1組圖1 Western印跡檢測人臍靜脈內皮細胞CyclinD1表達

表2 過表達NEAT1和高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響

2.3過表達NEAT1和高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響 與NG組相比，HG組人臍靜脈內皮細胞中Cleaved caspase-3表達水平及凋亡率顯著升高(P<0.05)；與HG+pcDNA組相比，HG+pcDNA-NEAT1組Cleaved caspase-3表達水平及凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖2，表3?？梢?，過表達NEAT1抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡。

圖2 過表達NEAT1和高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞凋亡及Cleaved caspase-3表達的影響

表3 過表達NEAT1和高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響

2.4NEAT1靶向miR-217調控其表達 Targetscan預測顯示NEAT1與miR-217存在結合位點見圖3。miR-217與WT-NEAT1共轉染的EAhy926細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見表4。si-NEAT1組miR-217表達量(0.68±0.03)明顯低于si-con組(1.01±0.01)，pcDNA-NEAT1組miR-217表達量(0.44±0.06)明顯低于pcDNA組(0.94±0.09)，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

圖3 NEAT1靶向miR-217

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5干擾miR-217和高糖誘導對人臍靜脈內皮細胞增殖和凋亡的影響 與HG+anti-miR-con組相比，HG+anti-miR-217組CyclinD1表達水平及存活率明顯升高，cleaved caspase-3表達水平及細胞凋亡率降低(P<0.05)。見表5，圖4?？梢姡蓴_miR-217促進高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞增殖，抑制細胞凋亡。

1、2：HG+anti-miR-con組、HG+anti-miR-217組圖4 Western印跡檢測CyclinD1和cleaved caspase-3蛋白表達

2.6過表達NEAT1和miR-217對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞增殖和凋亡的影響 與HG+pcDNA-NEAT1+miR-con組相比，與HG+pcDNA-NEAT1+miR-217組miR-217表達水平明顯升高，CyclinD1表達水平及細胞存活率明顯降低，cleaved caspase-3表達水平及細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見圖5，表6。可見，過表達miR-217可逆轉NEAT1對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞增殖促進和凋亡抑制的作用。

1、2：HG+pcDNA-NEAT1+miR-con組、HG+pcDNA-NEAT1+miR-217組圖5 Western印跡檢測CyclinD1和cleaved caspase-3蛋白表達

3 討 論

DM引起的慢性血管并發(fā)癥嚴重影響糖尿病患者的生活質量，危害極大〔11〕。血管內皮細胞損傷與DM血管病變密切相關，高濃度葡萄糖能抑制人臍靜脈內皮細胞增殖，促進細胞凋亡〔12〕。lncRNA和miRNA均屬于非編碼RNA，與DM血管病變疾病密切相關，可為其基因診斷與治療提供新靶點、新思路、新方法〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1通過激活miR-181d-5p/CDKN3軸可抑制氧化應激誘導的血管內皮細胞損傷〔14〕。NEAT1還介導三甲胺N-氧化物誘導的內皮細胞增殖〔15〕。CyclinD1是細胞周期相關蛋白〔16〕；cleaved caspase-3是細胞凋亡蛋白〔17〕，其表達水平影響細胞增殖和凋亡。本研究結果說明過表達NEAT1可抑制高糖誘導的細胞凋亡，促進細胞存活。

研究報道顯示高糖誘導血管內皮細胞miR-217表達上調〔18〕，本研究結果表明高糖處理的人臍靜脈內皮細胞中miR-217高表達。高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞中，miR-217通過調節(jié)Sirt1/HIF-1α通路促進炎癥反應及纖維化〔19〕。抑制miR-217通過恢復PTEN介導的自噬途徑可預防高葡萄糖誘導的足細胞損傷和胰島素抵抗〔20〕。本研究結果說明抑制miR-217表達促進細胞增殖，抑制高糖誘導的細胞凋亡。NEAT1可能通過靶向調控miR-217影響高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞增殖和凋亡。