蘭 艷，伍 鑫，王 錦，吳超越，段 強(qiáng)，彭立功，李 天

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，作物生理生態(tài)及栽培四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

綠米稻因葉綠素大量沉積在種皮而使糙米呈淺綠色，是寶貴的有色稻種質(zhì)資源，其稻殼呈紫色或紅色，富含花青素[1-2]。綠米米質(zhì)優(yōu)良，富含維生素、脂肪、葉綠素、膳食纖維及大量人體必需的微量元素。郭詠梅等[3]研究發(fā)現(xiàn)：綠米富含F(xiàn)e (9.02 mg/kg)和Zn (12.49 mg/kg)。韓磊等[2]認(rèn)為綠米的主要特點是含硒量高 (每100 g 綠米中含硒量高達(dá)23.2 mg)。硒是一種維持生命的物質(zhì)，當(dāng)攝入量不足時，將會出現(xiàn)細(xì)胞病變，造成癌癥及多種疾病的發(fā)生，被科學(xué)家譽(yù)為生命之火的“奇效元素”和“抗癌防癌之王”。綠米脂肪含量高達(dá)8%～9%，膠稠度高達(dá) 85%，屬于軟膠類型，蒸煮后米飯晶瑩透亮，不易回生變硬，咀嚼感好，感觀評價和綜合評分優(yōu)于黑米和紅米[4-5]。在中國豐富的稻種資源中蘊(yùn)藏著一些綠米品種，比如河南的南陽綠米、中國水稻研究所的綠玉、廣東育成的珍珠綠米、陜西育成的綠瑩香米和上海交大培育的純合香綠米品系[1,6-8]。有關(guān)有色稻米種質(zhì)資源評價、色素基因以及栽培技術(shù)等研究主要涉及常見的黑米和紅米，關(guān)于綠米的研究報道極少。本研究以引進(jìn)日本綠米稻品種ND4 為材料，研究施氮量對綠米稻葉綠素含量、產(chǎn)量及光合特性的影響，為綠米稻的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設(shè)計

供試品種為從日本引進(jìn)的綠米稻品種ND4，有芒，稻殼為紫色，全生育期155～158 d，成熟后大部分糙米為淺綠色，米粒大都半透明，米質(zhì)優(yōu)良。試驗于2017—2018 年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江試驗基地進(jìn)行。供試土壤0～20 cm 化學(xué)性狀為：有機(jī)質(zhì)含量為29.54 g/kg，全氮含量為1.76 g/kg，堿解氮含量為122.15 mg/kg，速效磷含量為66.21 mg/kg，速效鉀77.24 mg/kg，pH 7.0。

試驗采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，設(shè)置施純氮0 (N0)、90 kg/hm2(N90)、135 kg/hm2(N135)、180 kg/hm2(N180) 和225 kg/hm2(N225) 5 個 處理，以N0 為對照，小區(qū)面積12 m2，3 次重復(fù)。4 月16 日播種，5 月26 日移栽，每穴2 苗，行穴距為30 cm×25 cm。氮肥為尿素，按m(基肥)∶m(蘗肥)=7∶3 施入，磷肥為過磷酸鈣 (P2O590 kg/hm2)，鉀肥為氯化鉀 (K2O 180 kg/hm2)，基肥和全部磷鉀肥在移栽前1 d 施入，其余管理措施保持一致。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 土壤基礎(chǔ)肥力的測定

試驗前取耕作層 (0～20 cm) 土壤樣品，采用常規(guī)方法[9]測定土壤養(yǎng)分含量。

1.2.2 產(chǎn)量的測定

成熟期 (開花后35 d) 每小區(qū)選取30 株調(diào)查有效穗數(shù)；每小區(qū)按平均有效穗數(shù)選取5 株，調(diào)查每穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒質(zhì)量和理論產(chǎn)量等指標(biāo)。

1.2.3 穎果和葉片葉綠素含量的測定

水稻始穗期 (8 月22 日)，在每個小區(qū)掛牌標(biāo)記同日抽出的稻穗，分別于開花后10、15、20、25、30 和35 d 取樣。每次取樣于上午8：30—10：30 采標(biāo)記稻穗和劍葉，并以穗上部籽粒和去葉脈的葉片中部為測試材料。每次稱取0.5 g 穎果和0.1 g 葉片，分別放入25 mL 試管內(nèi)，向試管內(nèi)加入 [V(無水乙醇)∶V(丙酮)=5∶5] 混合浸提液20 mL，將試管置于黑暗中浸提穎果和穎殼中的葉綠素，待穎果和葉片完全褪色后，用浸提試劑定容至25 mL，以浸提試劑為空白，分別在波長663、646 和470 nm 處測定吸光度，并按以下公式計算：

葉綠素a 質(zhì)量濃度=12.2×OD663-2.83×OD646；

葉綠素b 質(zhì)量濃度=20.11×OD646-5.02×OD663；

葉綠素含量 (mg/g)=葉綠素a 或b 的質(zhì)量濃度 (mg/L) ×提取液總量 (mL)/穎果或葉片鮮質(zhì)量×1 000。

1.2.4 穎果總酚含量的測定

總酚含量用福林酚法參照張玲[10]的方法測定。

1.2.5 劍葉光合速率的測定

在水稻開花后10、15、20、25、30 和35 d的上午8：30—11：00 選取長勢一致的5 株，利用 LI-6400 型便攜式光合作用測定儀測定光合速率，取5 株平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)結(jié)果均為3 次重復(fù)的平均值，利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗，采用最小顯著性差異法 (LSD) 在P＜0.05水平上做多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮量對綠米穎果葉綠素含量的影響

2.1.1 施氮量對綠米穎果葉綠素a 含量的影響

如圖1 所示：綠米穎果中葉綠素a 的含量隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)表現(xiàn)出降低的趨勢，其中開花后15～20 d，下降速率最快。開花后10 d，N225處理下的葉綠素a 含量最高 (103.3 μg/g)，且顯著高于其他處理 (P＜0.05)，N135 和N180 處理下葉綠素a 含量顯著高于N90 和N0 (P＜0.05)；開花后15 d，N225 (81.0 μg/g)和N180 (80.6 μg/g) 處理下的葉綠素a 含量顯著高于其他處理 (P＜0.05)；開花后20 和25 d 各施氮處理間葉綠素a 含量差異不顯著；開花后30 d (臘熟期)，N135 處理下葉綠素a 含量 (34.2 μg/g) 顯著高于其他處理 (P＜0.05)，N180 (22.3 μg/g) 和N225 (27.1 μg/g) 處理間差異不顯著；開花后35 d (完熟期)，N225 處理下葉綠素a 含量最高 (26.4 μg/g)，各施氮處理間差異不顯著，但均顯著高于N0 處理 (9.2 μg/g) (P＜0.05)，分別比對照高186.95%、178.26%、140.22%和105.43%。表明施氮能顯著提高綠米穎果葉綠素a 含量。

圖1 施氮量對穎果葉綠素a、b 和總酚含量的影響)Fig.1 Effect of nitrogen application rates on the contents of chlorophyll a,b and total phenol in caryopsis

2.1.2 施氮量對綠米穎果葉綠素b 含量的影響

如圖1 所示：綠米穎果中葉綠素b 的含量隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)而降低，其中開花后15～20 d下降速率最快。開花后10 和15 d，葉綠素b 含量隨施氮量的增加而增加，N225 處理下含量最高，且各處理間差異顯著 (P＜0.05)；開花后20 d，N135(28.3 μg/g)、N180 (31.0 μg/g)和N225 (43.7 μg/g)處理間葉綠b 含量差異顯著 (P＜0.05)，且顯著高于N90 (21.3 μg/g)和N0 (19.5 μg/g)；開花后25 d，施氮量≥135 kg/hm2時，穎果葉綠素b 的含量差異不顯著，但顯著高于N90 和N0 (P＜0.05)；開花后30 d (臘熟期)，N225 處理下葉綠素b 含量(19.4 μg/g)分 別 比N0、N90、N135 和N180 高139.51%、42.65%、29.33%和16.16%；開花后35 d (完熟期)，穎果葉綠素b 的含量在N135(11.0 μg/g)、N180 (13.3 μg/g)和N225 (14.8 μg/g)處理間差異不顯著，但顯著高于N90 (6.0 μg/g)和N0 (5.1 μg/g) (P＜0.05)。表明開花后各個生育時期氮肥對綠米稻穎果中葉綠素b 含量影響較大，且隨施氮量增加而增加。

2.1.3 施氮量對不同成熟期綠米穎果葉綠素含量的影響

如表1 所示：穎果葉綠素含量隨施氮量的增加而增加，但隨成熟期的推進(jìn)呈下降趨勢 。其中臘熟期N135 處理下葉綠素含量最高，與N225處理差異不顯著；各處理下，完熟期相對臘熟期分別下降31.58%、23.38%、32.72%、0.51%和11.21%。表明高氮 (N180 和N225) 處理下，隨成熟期推進(jìn)穎果葉綠素含量下降率更低，色素更穩(wěn)定。就葉綠素含量而言，在臘熟期 (開花后30 d)能收獲葉綠素含量更高的綠米。

表1 施氮量對不同成熟期綠米穎果葉綠素含量的影響Tab.1 Effect of nitrogen application rates on the chlorophyll content in different maturity caryopsis μg/g

2.2 施氮量對綠米穎果總酚含量的影響

如圖1 所示：綠米穎果中總酚的含量隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)也表現(xiàn)出降低的趨勢。穎果中總酚的含量在各施氮處理下表現(xiàn)為N225＞N180＞N135＞N90＞N0。開花后10、20 和30 d，N225 處理下的穎果總酚含量顯著高于其他處理 (P＜0.05)，而N135 和N180 處理間差異不顯著；開花后15 d，N180 (119.77 mg/g)和N225 (123.72 mg/g)處理下穎果的總酚含量顯著高于其他處理(P＜0.05)；開花后25 d，施氮量≥180 kg/hm2時，穎果總酚含量顯著高于 N90 和N0 處理，且各處理間差異顯著(P＜0.05)；開花后35 d 各施氮處理間穎果總酚的含量分別為N225 (57.74 mg/g)＞N180 (55.34 mg/g)＞N135 (48.10 mg/g)＞N90 (45.20 mg/g)＞N0 (42.58 mg/g)。說明在綠米開花后各個生育時期氮肥對總酚的影響比較大。

2.3 施氮量對綠米劍葉光合特性的影響

2.3.1 施氮量對綠米劍葉葉綠素含量的影響

由圖2 所示：綠米劍葉葉綠素含量隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，在開花后20 d 含量最高。開花后各時段，不同施氮處理下劍葉葉綠素含量均隨施氮量的增加而增加。N180處理下開花后20 d 的葉綠素的含量在整個生育期最高 (3.99 mg/g)，比對照 (N0) 高48.51%，但與N225 差異不顯著；開花后25 d，葉綠素含量在各處理下相對于開花后20 d 分別下降9.33%(N0)、1.05% (N90)、3.16% (N135)、13.28% (N180)和10.80% (N225)；開花后30 d，葉綠素含量在各處理下相對于開花后25 d 分別下降28.56%(N0)、27.20% (N90)、24.10% (N135)、8.82%(N180)和5.68% (N225)；開花后35 d，光合速率下降變緩，各處理相對開花后30 d 分別下降4.67% (N0)、12.00% (N90)、12.36% (N135)、18.77% (N180)和15.81% (N225)。

圖2 施氮量對劍葉葉綠素含量和凈光合速率的影響)Fig.2 Effect of nitrogen application rates on the chlorophyll content and net photosynthetic rate (Pn) of flag leaves

2.3.2 施氮量對綠米劍葉光合速率的影響

如圖2 所示：隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，不同氮肥處理下的劍葉凈光合速率呈先增后降的變化趨勢，在開花后20 d 最高；從施氮水平來看，開花后各時段均隨施氮量的增加而增加。開花后20 d，各處理下凈光合速率分別為N225 [29.67 mol/(m2·s)]＞N180 [27.33 mol/(m2·s)]＞N135 [25.85 mol/(m2·s)]＞N90 [25.24 mol/(m2·s)]＞N0 [20.27 mol/(m2·s)]；開花后25 d，光合速率下降緩慢，各處理相對于開花后20 d 分別下降22.94% (N0)、19.69% (N90)、9.98% (N135)、11.31% (N180)和4.89% (N225)；開花后30 d，光合速率下降最快，各處理相對于開花后25 d 分別下降21.93% (N0)、38.83%(N90)、42.63% (N135)、38.73% (N180)和43.70%(N225)；開花后35 d，光合速率下降變緩，各處理相對開花后30 d 分別下降19.65% (N0)、18.10% (N90)、16.26% (N135)、21.48% (N180)和16.01% (N225)。

2.4 施氮量對綠米產(chǎn)量的影響

如表2 所示：有效穗數(shù)隨著施氮量的增加而增加，且各處理間差異顯著 (P＜0.05)；千粒質(zhì)量也隨施氮量增加而增加，N225 處理顯著高于N0 和N90 (P＜0.05)，其余各處理間差異不顯著；穗粒數(shù)及產(chǎn)量隨著施氮量的增加呈先增后降的變化趨勢，在N180 處理下產(chǎn)量達(dá)到最大值，為4.66 t/hm2，當(dāng)施氮量超過180 kg/hm2時產(chǎn)量下降。當(dāng)施氮在量0～180 kg/hm2范圍內(nèi)，施用氮肥增加了綠米的有效穗數(shù)和穗粒數(shù)，因而產(chǎn)量增加，而當(dāng)施氮量超過這個范圍時，穗粒數(shù)、結(jié)實率和產(chǎn)量均降低。

表2 施氮量對綠米稻產(chǎn)量構(gòu)成及產(chǎn)量的影響Tab.2 Effect of nitrogen application rates on the yield components and yield of green rice

3 討論

3.1 施氮量對綠米葉綠素含量的影響

研究表明：水稻穎果在發(fā)育初期呈綠色，這是因為果皮中層細(xì)胞中含有葉綠體的緣故[11]。柳敏[12]對黑米的研究發(fā)現(xiàn)：從外觀上看，黑米穎果發(fā)育早期果皮呈綠色，表明其穎果中也含有葉綠素，但隨著花色素的積累，果皮逐漸呈現(xiàn)花色素的顏色，葉綠素顏色被花色素掩蓋，其存在與否從外表上已無法辨別；利用熒光顯微鏡觀察穎果橫切面，發(fā)現(xiàn)穎果中的葉綠素只存在于果皮細(xì)胞中，且靠近背部維管束的部位最為豐富；穎果發(fā)育前中期，葉綠素含量較多，往后逐漸減少，開花后28 d 時葉綠素含量已經(jīng)很低，而開花后35 d時幾乎不存在。本試驗中，綠米穎果葉綠素含量和前人研究結(jié)論相似，隨著綠米稻生育進(jìn)程的推進(jìn)，葉綠素含量逐漸降低，因此為保證綠米色澤，收獲期不宜太遲。本試驗結(jié)果表明：在開花后30 d (臘熟期) 收獲為宜。葉綠素是含氮化合物，本試驗中隨施氮量的增加葉綠素含量總體呈增加的趨勢，且施氮處理的葉綠素含量均顯著高于不施氮，說明施氮量能提高綠米穎果葉綠素含量。

總酚包括多酚和單酚，是廣泛存在于蔬菜、水果、豆類和谷物類等植物中的復(fù)雜次生代謝物[13]。酚類化合物一般可以分為兩大類：一類是多酚體，主要包括苯丙烷類和類黃酮化合物；另一類則是由多個單聚體聚集成的低聚體或多聚體，統(tǒng)稱單寧類物質(zhì)[14]。由于綠米穎殼為紫色，推測其可能含有大量花青素及酚類等次生代謝物，而穎果卻呈綠色，因此本研究測定了穎果花青素和總酚含量。但由于穎果中花青素含量低于所用方法的檢測限值，所以并未測出。研究發(fā)現(xiàn)：水稻籽粒中絕大多數(shù)代謝物隨籽粒發(fā)育呈顯著下降趨勢，本試驗中總酚含量與葉綠素均隨生育期的推進(jìn)降低。不同施氮處理下，總酚含量隨施氮量的增加而增加，這與前人研究結(jié)果相似。吳碧球等[15]研究表明：水稻葉片總酚含量與施氮量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。李耀光[16]研究發(fā)現(xiàn)：不同粒色小麥品種對氮磷肥配比的響應(yīng)不同，豫麥49-198 在高氮 (N2P1 和N2P2) 處理下總酚含量較高，紅麥則以N1P2 處理時的總酚含量較高，黑小麥新周1 號在N2P2 條件下總酚含量較高。此外，本研究發(fā)現(xiàn)：成熟期綠米穎果葉綠素和總酚在中高氮 (N135、N180 和N225) 處理下差異不顯著，這是由于隨生育進(jìn)程推進(jìn)，籽粒的發(fā)育效應(yīng)大于氮素調(diào)控效應(yīng)[17]。

3.2 施氮量對綠米劍葉光合特性的影響

研究表明：增施氮素能顯著提高植物葉片氮素和光合色素含量，改善植物光合性能，增強(qiáng)葉片生理活性[18-19]。氮是水稻的必需元素，對水稻葉片生長及葉片的光合能力影響很大。增施氮肥可以增加葉綠素含量，延長葉片功能期，提高光合效率，但隨著施氮量的增加，無效分蘗增多，氮素較多地積累在營養(yǎng)器官中，不利于從源到庫的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致抽穗后葉綠素含量降低[20-21]。本試驗結(jié)果表明：隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，劍葉葉綠素含量呈先增后降的趨勢，在開花后20 d 最高，此時在不同的施氮水平下表現(xiàn)為N180＞N225＞N135＞N90＞N0?？赡苁怯捎谑┑窟^大導(dǎo)致劍葉葉面積加大，葉片變薄，葉綠素相對含量會隨之下降[22]。說明適宜的施氮量能有效提高綠米稻劍葉中葉綠素的含量，可以提高水稻后期光合作用強(qiáng)度，從而為生產(chǎn)高含量葉綠素的綠米稻產(chǎn)品提供了可能途徑。

光合作用是作物生長發(fā)育的決定性因素，光合速率是表征光合能力的重要參數(shù)之一[23]。本試驗結(jié)果顯示：開花后各時段隨施氮量的增加光合速率提高；隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，呈先增后降的趨勢，在開花后20 d 最大；在開花后20～25 d 下降緩慢，開花后25～30 d 下降速率最快。表明增施氮肥可提高水稻劍葉的光合速率，增強(qiáng)PSⅠ和PSⅡ的電子傳遞能力，延長葉片光合速率高值持續(xù)期，改善光合性能，增加非光化學(xué)猝滅 (NPQ)，增強(qiáng)生育后期葉片的PSⅡ潛在活性、PS 最大光化學(xué)效率和葉片生理活性，延緩中、下部葉片的衰老，增加生育后期的光合產(chǎn)量[24-25]。同時研究表明：施氮加快后期碳氮代謝的速率，光合強(qiáng)度增加，可以提高后期葉片的光化學(xué)猝滅，提高葉片凈光合速率[26]。

3.3 施氮量對綠米產(chǎn)量的影響

研究表明：當(dāng)?shù)厥┯盟接傻椭饾u增高時，產(chǎn)量隨氮素用量的增加相應(yīng)的提高，但是當(dāng)?shù)赜昧窟_(dá)到一定水平時，再增加氮素，產(chǎn)量提高并不顯著，甚至造成減產(chǎn)[27-28]。關(guān)于水稻適宜施氮量的研究較多，由于試驗品種、方法及條件的不同，結(jié)果也有差異[29-31]。從夕漢等[32]認(rèn)為：施氮量為120～270 kg/hm2時，水稻籽粒產(chǎn)量增幅最大，超過270 kg/hm2時則下降。張桂蓮等[33]研究表明：適宜的施氮量能增加穗粒數(shù)和結(jié)實率，但不能超過150 kg/hm2。盧浩宇等[34]研究表明：隨施氮量增加，紫米稻分蘗增加、成穗率提高、葉面積增大、物質(zhì)積累增多以及產(chǎn)量顯著提高。本試驗結(jié)果表明：產(chǎn)量隨氮肥用量的增加而呈先增后降的趨勢，并以N180 處理時達(dá)到最高。在0～180 kg/hm2范圍內(nèi)，穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量均隨著施氮量的增加而增加；但當(dāng)施氮量超過180 kg/hm2，穗粒數(shù)和結(jié)實率均降低導(dǎo)致產(chǎn)量降低；這可能是過高的施氮量導(dǎo)致水稻貪青晚熟，植株干物質(zhì)積累過多，但向穗部轉(zhuǎn)移少，空癟粒增加[35]。因此，適宜的施氮量才能強(qiáng)化光合產(chǎn)物向穗部轉(zhuǎn)移，以此達(dá)到充實的目的，提高氮素偏生產(chǎn)力，進(jìn)而提高產(chǎn)量。

4 結(jié)論

綠米穎果中葉綠素及總酚的含量均隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)表現(xiàn)出降低的趨勢；開花后各個生育時期綠米穎果中葉綠素及總酚含量隨施氮量增加而增加。此外，高氮 (N180、N225) 處理下，隨成熟期推進(jìn)穎果色澤更穩(wěn)定。綠米劍葉葉綠素含量及凈光合速率隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，在開花后20 d 達(dá)到峰值；開花后各時段隨施氮量的增加而增加。產(chǎn)量在N180(180 kg/hm2) 處理下達(dá)到最大值 (4.66 t/hm2)，當(dāng)超過180 kg/hm2時產(chǎn)量下降；產(chǎn)量構(gòu)成因子中，有效穗數(shù)和千粒質(zhì)量隨施氮量增加而增加，穗粒數(shù)和結(jié)實率隨著施氮量的增加呈先增后降的變化趨勢。因此，本試驗條件下綠米高產(chǎn)栽培條件為N180 (180 kg/hm2) 處理，且在臘熟期 (開花后30 d)能收獲葉綠素含量更高的綠米。