熊 喆，鄒 迪，施德佳，楊鑫嬌,4，卿玉波，魏紅江,5，趙紅業(yè)

(1.云南省動物基因編輯與體細胞克隆技術重點實驗室，云南 昆明 650201；2.云南農業(yè)大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；3.云南省異種器官移植工程研究中心，云南 昆明 650201；4.大理大學 藥學與化學學院，云南 大理 671000；5.云南農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201)

p53基因作為一個重要的抑癌基因，可通過誘導細胞周期阻滯、細胞凋亡及自噬等途徑，對腫瘤細胞增殖及發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要的調控作用[1]。有研究報道：p53調節(jié)細胞自噬水平的途徑主要決定于其亞細胞定位，細胞質p53可對細胞自噬發(fā)揮負性調節(jié)作用進而抑制細胞自噬的發(fā)生[2]，細胞核p53基因可作為轉錄因子激活mTOR 上游的一些調節(jié)因子上調細胞自噬水平[3]。p53參與調控細胞自噬的途徑主要涉及損傷調節(jié)自噬因子和激活AMPK 通路，或抑制哺乳動物雷帕霉素(mTOR)途徑的靶點，或通過激活AMP 反應蛋白酶(AMPK)途徑誘導細胞自噬[4]。當細胞處于應激狀態(tài)下，p53可激活BAX、BNIP3 和PUMA 等因子解除Bcl-2/Bcl-xL 和Beclin1 之間的抑制作用，進而可上調細胞自噬水平[5]；正常狀態(tài)下，p53基因可通過誘導細胞周期阻滯和凋亡等途徑抑制細胞增殖和促進分化[6]，誘導細胞自身修復機制的激活以及導致細胞死亡，保護細胞免受由DNA 損傷引起的基因突變[7]。

自噬是一種將細胞成分傳遞給溶酶體進行降解回收的途徑，是一種進化保守的機制，能夠降解細胞中包括各種細胞器、蛋白質和入侵微生物等不同成分[8]。在調控細胞能量代謝[9]、腫瘤發(fā)生[10]、細胞生長及死亡[11]等生理過程中發(fā)揮著重要的作用。自噬體的形成依賴于一系列從酵母到哺乳動物高度保守的自噬相關基因(ATG)[12]。哺乳動物中的ATG9A 是ATG9 酵母同源蛋白，是ATG 核心蛋白中唯一的多跨膜蛋白，對自噬體的運輸起著重要的作用[13]。ATG9A 主要定位于反式高爾基體網絡和核內體系統(tǒng)，通過囊泡運輸并在高爾基體和核內體系統(tǒng)之間循環(huán)[14]。在外界營養(yǎng)豐富的條件下，ATG9A 主要位于核周區(qū)及部分早期和循環(huán)核內體，氨基酸饑餓時，ATG9A核周減少，伴隨囊泡群體的增加而增加，這與自噬小體標記物的部分共定位相一致[15]。

凋亡是維持機體組織功能和體內平衡的程序性細胞死亡的過程[16]，凋亡的發(fā)生對腫瘤細胞的增殖及癌癥的發(fā)生調控起著重要的作用[17]。凋亡細胞主要表現(xiàn)為形態(tài)收縮、染色質濃縮、膜泡化和可見凋亡小體形成[18]。在細胞凋亡發(fā)生的過程中，含有死細胞內容物的凋亡小體可被周圍細胞吞噬[16]?？沟蛲鯞 細胞淋巴瘤2 家族成員(Bcl-2、MCL1、Bcl-xL、Bcl-W 和BFL1)是調節(jié)細胞凋亡發(fā)生的關鍵成員，這些基因的失調不僅會損害機體的正常發(fā)育，還會導致腫瘤發(fā)生和對各種抗癌療法的抵抗。因此，細胞可啟動相關調節(jié)機制嚴格控制抗凋亡Bcl-2 家族成員的表達[19]。

基于已有研究報道，p53wt和p53-/-PFCs 均可在EBSS 饑餓誘導處理下發(fā)生自噬[20]。本研究進一步觀察饑餓誘導、Baf A1 處理和自噬阻斷2 h后p53wt和p53-/-PFCs 的細胞形態(tài)學差異，檢測不同處理組的細胞凋亡水平、增殖及Bcl-2 和ATG9A 蛋白的表達差異，為進一步闡明p53基因與自噬和凋亡相關的分子調控機制奠定重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型豬成纖維細胞(p53wtPFCs)和p53基因敲除豬成纖維細胞(p53-/-PFCs)均由云南省動物基因編輯與體細胞克隆技術重點實驗室構建[21]。

1.2 方法

1.2.1 細胞系培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS，Ausbian)和1.0%青—鏈霉素溶液(PS，BI)的DMEM培養(yǎng)基中，置于38 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)，隔天換液，直至細胞生長匯合度為50%～60%時進行相應處理。

1.2.2 細胞形態(tài)學觀察

p53wt和p53-/-PFCs 分別利用EBSS (Earle’s平衡鹽溶液，Thermo Fisher Scientific)、Baf A1(巴弗洛霉素A1，上海生工)和EBSS+Baf A1 處理2 h 后，分別置于顯微鏡(ZEISS，型號AXIO)下，在5×、10×和20×物鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照，比較并分析不同處理下細胞形態(tài)變化情況。

1.2.3 細胞增殖檢測

分別取對數(shù)生長期的p53wt和p53-/-PFCs 消化沉淀進行準確計數(shù)，經含10% FBS 和1.0%PS 的DMEM 完全培養(yǎng)液稀釋后，按2 000 個細胞/孔的密度接種于96 孔板，設空白對照(空白培養(yǎng)基，無細胞)、細胞對照(未經EBSS、Baf A1 或EBSS+Baf A1 處理)和處理組，置于38 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，處理組分別利用EBSS、Baf A1 和EBSS+Baf A1 處理2 h，每個處理3 個重復。參照CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒說明書(全式金，Code#FC101-02)進行后續(xù)相關試驗，通過全波長酶標儀(Thermo Fisher，型號1510)測定450 nm 處的OD 值，計算出各處理組細胞的增殖率。

增殖變化率(A)=(OD處理-OD對照)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.2.4 細胞凋亡檢測

p53wt和p53-/-PFCs 分別利用EBSS、Baf A1和EBSS+Baf A1 各處理2 h 后，參照細胞凋亡試劑盒檢測說明書(四正柏生物，F(xiàn)XP018)，經磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗2 次，用0.25% Trysin-EDTA 消化，加入原細胞培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打數(shù)次后轉移至15 mL 離心管內，1 000 r/min離心5 min 收集細胞沉淀，棄上清，加入1 mL預冷PBS 重懸細胞，再次離心沉淀細胞，棄上清，細胞沉淀用PBS 重懸計數(shù)。各處理組取5×104個細胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入500 μL 1×結合緩沖液(用去離子水按體積比1∶3 稀釋)輕輕重懸后，先加入5 μL AnnexinVFITC 室溫孵育10 min，再加入10 μL 碘化丙啶(PI)混勻，隨即進行流式細胞儀(Beckman Coulter，型號BC11093)上機檢測。

1.2.5 Western-blot 檢測

利用Western-blot 檢測EBSS 饑餓誘導2 h 后的p53wt和p53-/-PFCs ATG9A 及Bcl-2 蛋白的表達差異。參照已有研究[22]報道分別提取細胞總蛋白并進行蛋白免疫印跡試驗。p53wt和p53-/-PFCs 分別利用EBSS、Baf A1 和EBSS+Baf A1各處理2 h 后，經PBS 洗2 次后用細胞刷刮下離心收集細胞，參照試劑盒說明書(RIPA Lysis Buffer，中國)完全裂解細胞后獲得細胞總蛋白，利用BCA 法(BCA 蛋白濃度測定試劑盒，碧云天，中國)測定細胞總蛋白濃度。蛋白樣品(總蛋白20 μg)通過12.0%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再轉移至聚偏二氟乙烯膜上。在5%牛血清白蛋白(BSA)緩沖液中孵育60 min，與用抗體稀釋液(Beyotime，中國)稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，一抗稀釋倍數(shù)分別為Bcl-2 (Affinity，美國)1 000 倍、ATG9A (Abcam，英國) 5 000 倍和β-actin (Sigma，美國) 3 000 倍；之后，再與5 000 倍稀釋的二抗(R &D，美國)室溫孵育90 min，再在PBST 中洗滌3 次，10 min/次，通過ECL (Easysee，TRANS，中國)孵育3 min后，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)(BioRad，Hercules，美國)中進行蛋白表達量顯影。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 饑餓誘導對p53wt 和p53-/- PFCs 形態(tài)的影響

由圖1 可知：與對照相比，p53wt和p53-/-PFCs細胞經饑餓誘導(EBSS)和自噬阻斷(EBSS+Baf A1)處理后，細胞膜表面均出現(xiàn)皺縮，形成若干波動式的褶皺和較長的突起，長出絲狀偽足，而僅經Baf A1 處理后并未出現(xiàn)上述的細胞形態(tài)變化；經饑餓誘導和自噬阻斷處理的p53-/-PFCs形態(tài)變化率均極顯著低于p53wtPFCs (63.3% vs 89.4%，46.2% vs 73.8%，P＜0.01)。說明饑餓誘導促進PFCs 形態(tài)變化，p53基因敲除抑制PFCs形態(tài)變化。

圖1 p53wt 和p53-/-PFCs 饑餓誘導后細胞形態(tài)變化)Fig.1 The morphological changes of p53wt and p53-/- PFCs after starvation induction

2.2 饑餓誘導對p53wt 和p53-/- PFCs 中ATG9A蛋白表達水平的影響

由圖2 可知：在p53-/-PFCs 中，與對照組相比，饑餓誘導(EBSS)后ATG9A 蛋白表達水平極顯著上調(P＜0.01)，Baf A1 處理后ATG9A 蛋白表達水平無顯著變化(P＞0.05)，自噬阻斷(EBSS+Baf A1)后ATG9A 蛋白表達水平顯著上調(P＜0.05)；在p53wtPFCs 中，與對照組相比，饑餓誘導及自噬阻斷后ATG9A 蛋白表達水平均無顯著變化(P＞0.05)。在對照組中，與p53wtPFCs 相比，p53-/-PFCs 中ATG9A 蛋白表達水平顯著上調(P＜0.05)。進一步通過饑餓誘導和自噬阻斷后，與p53wtPFCs 相比，p53-/-PFCs 中ATG9A蛋白表達水平極顯著上調(P＜0.01)。說明p53基因敲除能顯著上調饑餓誘導PFCs 自噬相關蛋白ATG9A 蛋白表達水平，且自噬阻斷后上調了ATG9A 蛋白的表達水平。

圖2 p53wt 和p53-/- PFCs 經饑餓誘導、Baf A1 和自噬阻斷后ATG9A 蛋白表達水平)Fig.2 The ATG9A protein expression level in p53wt and p53-/- PFCs treated with with EBSS,Baf A1 and EBSS+Baf A1

2.3 饑餓誘導對p53wt 和p53-/- PFCs 增殖的影響

由表1 可知：饑餓誘導(EBSS)、Baf A1 和自噬阻斷(EBSS+Baf A1)后，p53-/-PFCs 和p53wtPFCs 的增殖率均下降。在細胞對照組中，p53-/-PFCs 的增殖速度顯著快于p53wtPFCs (P＜0.05)。說明自噬降低了p53-/-PFCs 的增殖，但p53基因敲除促進PFCs 增殖。

表1 不同處理下p53wt 和p53-/- PFCs 的增殖率 Tab.1 The proliferation rate of p53wt and p53-/- PFCs under different treatment

表1 不同處理下p53wt 和p53-/- PFCs 的增殖率 Tab.1 The proliferation rate of p53wt and p53-/- PFCs under different treatment

注：空白對照. 空白培養(yǎng)基，無細胞；細胞對照. 未經 EBSS、Baf A1 或 EBSS+Baf A1 處理；“*”表示差異顯著 (P＜0.05)。Note: control. blank medium, no cells; cell control. not processed by EBSS, Baf A1 or EBSS+Baf A1; “*” significant difference P＜0.05.

處理treatment p53wt p53-/-OD值absorbance增殖變化率/%proliferation rate of change OD值absorbance增殖變化率/%proliferation rate of change空白對照組 control 0.041±0.001 — 0.041±0.001 —細胞對照組 cell control 0.388±0.008 0.00 0.606±0.071* 0.00饑餓誘導組 EBSS 0.310±0.007 -22.49 0.368±0.047 -32.82巴弗洛霉素A1組 Baf A1 0.347±0.003 -12.01 0.434±0.038 -19.39自噬阻斷組 EBSS+Baf A1 0.308±0.012 -23.16 0.341±0.042 -38.37

2.4 饑餓誘導對p53wt 和p53-/- PFCs 凋亡水平的影響

由圖3 可知：在p53-/-PFCs 中，與對照組相比，饑餓處理(EBSS)后顯著上調了細胞凋亡水平(P＜0.05)，自噬阻斷后(EBSS+Baf A1)細胞凋亡水平無顯著變化(P＞0.05)；在p53wtPFCs 中，與對照組相比，饑餓處理及自噬阻斷后細胞凋亡水平無顯著變化(P＞0.05)。說明p53基因缺失時，饑餓處理促進PFCs 凋亡，自噬阻斷后凋亡無顯著變化。

圖3 p53wt 和p53-/- PFCs 饑餓誘導后細胞凋亡檢測結果)Fig.3 The apoptosis analysis of p53wt and p53-/- PFCs after starvation induction

2.5 饑餓誘導對p53wt 和p53-/- PFCs Bcl-2 蛋白表達水平的影響

由圖4 可知：在p53-/-PFCs 中，與對照組相比，饑餓誘導(EBSS)和自噬阻斷(EBSS+Baf A1)后Bcl-2 蛋白表達無顯著變化(P＞0.05)；在p53wtPFCs 中，與對照組相比，經饑餓誘導及自噬阻斷后，Bcl-2 蛋白表達水平均顯著上調(P＜0.05)。此外，對照組中，與p53wtPFCs 相比，p53-/-PFCs 的Bcl-2 蛋白表達水平顯著下調(P＜0.05)；進一步通過饑餓誘導及自噬阻斷2 h 后，與p53wtPFCs 相比，p53-/-PFCs 中Bcl-2 蛋白的表達水平極顯著下調(P＜0.01)。說明p53基因缺失能顯著下調饑餓誘導的PFCs 自噬相關蛋白Bcl-2 的表達水平。

圖4 p53wt 和p53-/-豬成纖維細胞經饑餓誘導、Baf A1 和自噬阻斷后Bcl-2 蛋白表達水平)Fig.4 The Bcl-2 protein expression level in p53wt and p53-/- PFCs treated with with EBSS,Baf A1 and EBSS+Baf A1

3 討論

自噬體的形成是自噬發(fā)生的重要標志，ATG 蛋白在自噬發(fā)生及自噬體的形成過程中具有重要的作用[23]。在饑餓誘導過程中，ATG9 囊泡作為組成自噬體膜的基本結構單元之一，可被整合到自噬體外膜上，進一步促進自噬體的形成[24]。ATG9A 作為ATG9 的同源蛋白，在自噬體的形成和/或其初始擴張階段中發(fā)揮重要的調控作用[25]。我們前期的研究表明：饑餓誘導2 h后，p53wtPFCs 未發(fā)生自噬，但p53-/-PFCs 發(fā)生自噬且ATG9A mRNA 表達水平顯著升高[20]。本研究表明：p53基因缺失能顯著上調饑餓誘導PFCs 自噬相關蛋白ATG9A 的表達水平，提示p53基因缺失促使饑餓誘導的PFCs 自噬，其自噬與ATG9A 密切相關，這與TAKAHASHI 等[26]的研究結果一致，即饑餓條件下HeLa 細胞中免疫熒光監(jiān)測ATG9A 表達顯著升高。此外，經自噬阻斷后，ATG9A 蛋白的表達水平上調，這可能是因為Baf A1 在抑制自噬體和溶酶體結合過程中發(fā)揮作用[27]，而在ATG9A 蛋白參與的自噬體形成過程中未發(fā)揮作用。

缺乏營養(yǎng)或發(fā)生應激反應時，細胞的形態(tài)通常會發(fā)生變化[28]。本研究饑餓誘導后，豬成纖維細胞在形態(tài)上發(fā)生細胞膜表面皺縮，形成若干波動式的褶皺和較長的突起，長出絲狀偽足。長出的絲狀偽足可能是薄的富含肌動蛋白的質膜突起，這可能為細胞探測外界環(huán)境[29]，且p53-/-PFCs 中細胞形態(tài)變化率低于p53wtPFCs。該結果提示：p53基因在饑餓條件下可通過調控細胞相關信號通路來改變細胞形態(tài)，以應對不利環(huán)境條件，從而維持細胞穩(wěn)態(tài)，促進細胞生存。另外，饑餓誘導后p53wtPFCs 未發(fā)生自噬，而p53-/-PFCs發(fā)生自噬且細胞形態(tài)變化率低，提示自噬反過來可降低細胞對饑餓的敏感性。

凋亡是細胞程序性死亡的重要途徑[17]。Bcl-2 家族的成員參與凋亡調節(jié)[30]，抗凋亡Bcl-2 蛋白是凋亡發(fā)生的關鍵調節(jié)因子，在監(jiān)測細胞生長和增殖以及調節(jié)生物體的遺傳程序中起著核心作用[31]。本研究結果顯示：p53基因在某種程度上可通過調控細胞相關信號通路來維持細胞的生長和增殖，對維持細胞的生長和代謝功能起著重要的作用，且在p53-/-PFCs 中，饑餓誘導時凋亡水平升高，自噬阻斷后凋亡水平無變化，進一步證明自噬具有促凋亡作用，與CHEN 等[32]的研究結果一致。有研究表明：血清饑餓可上調Bcl-2 蛋白的表達水平[33]。在本研究中，饑餓誘導p53wtPFCs 發(fā)生饑餓應答，Bcl-2 蛋白表達水平顯著上調；而在p53-/-PFCs 中，Bcl-2 蛋白表達水平無顯著變化。這進一步提示p53基因在細胞凋亡拮抗蛋白Bcl-2 表達調控過程中發(fā)揮著重要的作用，其具體的分子機制還需進一步研究。

4 結論

饑餓誘導下p53-/-PFCs 的細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，增殖率降低，ATG9A 蛋白表達水平升高，Bcl-2 蛋白表達水平無變化，且自噬發(fā)生時凋亡水平上調。其機制可能是饑餓誘導的p53-/-PFCs 自噬促進凋亡，這為進一步研究p53基因與自噬相關蛋白的表達調控及腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定了重要的理論基礎。