徐志強，李豐耘，趙凈穎，豆騰飛，王 坤，黃 英，葛長榮，賈俊靜

(云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201)

黑色素是一種由黑色素細胞分泌的酪氨酸酶(TYR)催化體內(nèi)酪氨酸羥化合成的聚合物，擁有復雜的結(jié)構(gòu)。黑色素生成由酪氨酸經(jīng)酪氨酸酶催化下轉(zhuǎn)化為多巴(即3,4-二羥基苯丙氨酸，DOPA)，多巴在酪氨酸酶的作用下進一步氧化為多巴醌(DQ)，多巴醌經(jīng)多聚化反應與氧化反應生成多巴色素，多巴色素經(jīng)過羧化和脫羧化形成中間體5,6-二羥基吲哚(DHI)和5,6-二羥基吲哚羧酸(DHICA)，之后二者在酪氨酸酶及其相關(guān)蛋白的作用下形成中間產(chǎn)物5,6-吲哚醌(IQ)和5,6-吲哚醌羧酸(IQCA)，最后2 種中間產(chǎn)物結(jié)合形成的異聚體即為真黑色素(eumelanin)。而在酪氨酸氧化剛開始形成的多巴醌有谷胱甘肽和半胱氨酸的參與后，產(chǎn)生谷胱氨酰多巴和谷胱氨酰多巴醌，最后形成褐黑色素(pheomelanin)[1-3]。黑色素主要由真黑色素和褐黑色素(pheomelanin)混合而成。TYR 是影響黑色素生成的限速酶，由酪氨酸酶(TYR)基因編碼[4]。一些研究表明：TYR基因與家雞黑色素沉積有關(guān)[5-6]。陸曉屏等[5]研究不同羽色他留烏骨雞(麻羽、白羽和黑羽)的TYR基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)他留烏骨雞TYR基因變異與羽毛性狀顯著相關(guān)。趙振華等[6]研究顯示：配對框3 (Pax3)和TYR基因的表達與肉雞脛皮膚黑色素高度沉積有關(guān)，Pax3下調(diào)可以促進TYR的表達，從而使黑色素細胞的黑色素生成增加。

武定雞主產(chǎn)于云南省楚雄彝族自治州的武定和祿勸兩縣，屬于地方肉用型雞種，具有體大、肉質(zhì)肥嫩和鮮美等特點[7]。武定雞的肉、膚顏色分為烏和非烏2 種，武定雞烏肉、膚的形成可能與其黑色素的沉積有關(guān)。據(jù)武定縣史料記載，現(xiàn)存的武定雞是由山東引進的‘九斤黃’與武定縣本地土雞進行自然雜交，并經(jīng)過民間長期飼養(yǎng)(自然選擇和淘汰)而形成的地方優(yōu)良品種[8]。因武定雞繁育體系存在血緣混雜化以及人們對烏骨雞的喜愛，所以對武定雞的烏骨品系選育極為重要。本研究選用武定烏骨品系雞和非烏骨品系雞為試驗動物，在相同飼養(yǎng)條件下，測定300 日齡時2 個品系雞的血漿TYR 活力、總黑色素含量以及血漿比色OD 值等黑色素指標；采用直接測序法分析武定雞TYR基因外顯子的多態(tài)位點(SNP)；并測定雞種各組織中的TYR基因mRNA 表達量，比較兩品系間的差異。本研究旨在找出兩品系(烏骨和非烏骨)武定雞TYR基因外顯子的差異SNPs 位點，以期為烏度更深的武定雞的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

武定雞種雞群是從祿勸縣和武定縣交通不暢的鄉(xiāng)鎮(zhèn)選購種雞所組建的核心群，并經(jīng)過7 個世代于云南農(nóng)業(yè)大學后山雞場進行閉鎖繼代選育所得的種雞群。本試驗選取400 只300 日齡健康的武定烏骨品系雞為主要研究對象(試驗組)，以400 只武定非烏骨品系雞為對照。武定雞繁育飼養(yǎng)在云南農(nóng)業(yè)大學教學實習雞場，飼養(yǎng)環(huán)境條件相同，并按期接種疫苗。試驗雞日糧參照《NY/T 33—2004 雞飼養(yǎng)標準》[9]及美國NRC 飼養(yǎng)標準配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 膚色分群

通過使用色彩色差儀對九階灰度卡(圖1)9 個灰度(1～9 號)以及純白(0 號)和純黑(10 號)進行檢測(表1)，按照L*(亮度)值劃分白膚[L*＞3 號(L*=71.770)]和烏膚[L*＜5 號(L*=54.850)]的標準，并結(jié)合九階灰度卡通過肉眼對武定雞進行膚色分群(組)。

表1 九階灰度卡對應L＊值Tab.1 Nine grayscale cards correspond to L values

圖1 九階灰度卡)Fig.1 Nine-order grayscale card

1.2.2 樣品采集

300 日齡時挑選已通過膚色分群的兩品系武定雞母雞各150 只(總共300 只)，提前禁食12 h后，清晨使用真空抗凝血管(含EDTA2K 抗凝劑)對武定雞翅下靜脈采集血液。一部分血液離心獲得血漿(3 000 r/min 離心30 min，取上清)，分離的血漿用于黑色素指標的測定；另一部分血液用于提取基因組DNA。隨機挑選兩品系武定雞母雞各20 只進行屠宰，提前12 h 禁食禁水，頸動脈放血，采集胸肌、腿肌、心、肝、脾、腎、肌胃和背部皮膚等組織樣放入凍存管內(nèi)，置于液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血漿TYR 活力和總黑色素含量測定

血漿TYR 活力和總黑色素含量的測定使用ELISA 試劑盒(上海羽朵生物科技有限公司)和酶標儀進行檢測。

1.2.4 血漿顏色的測定

將血漿與生理鹽水以1∶7 的體積比混合后，以生理鹽水為空白對照，使用酶標儀在波長475 nm 處測吸光值。

1.2.5TYR基因PCR 測序

(1) 血液DNA 提取

使用DP304 TIANGEN 血液DNA 提取試劑盒(TaKaRa 寶生物工程有限公司)提取基因組DNA。

(2) 引物設計

利用ENSEMBL (http://asia.ensembl.org/index.html)和NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)選擇紅色原雞TYR基因序列(序列號：NM_204160)，利用DNAMAN 設計本試驗所有外顯子區(qū)域引物，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表2。

表2 引物序列及具體信息Tab.2 Primer sequence and specific information

(3) PCR 反應

PCR 反應體系：DNA 模板1 μL，2×TSINGKETM Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L Primer F 0.5 μL，10 μmol/L Primer R 0.5 μL，dd H2O 11 μL。PCR 反應條件：94 ℃變性 5 min 后，94 ℃ 30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共 35 個循環(huán)；最后 72 ℃保溫 7 min。

1.2.6TYR基因表達量的檢測

(1) 總RNA 提取及cDNA 合成

RNA 提取及cDNA 合成均參照試劑盒(TaKa-Ra 寶生物工程有限公司)說明書進行。(2) Real-time PCR 檢測目的基因相對表達量通過上述試驗獲得的cDNA 為模板，使用引物設計軟件primer 5.0 設計TYR基因及內(nèi)參β-actin的引物，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，信息見表3。

表3 實時熒光定量PCR 引物信息Tab.3 Real-time fluorescence quantitative PCR primer information

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2016 進行分類整理，再用SPSS 21.0 和SAS 9.2 軟件進行獨立性樣本t檢驗。

TYR基因單個SNP 位點不同基因型，模型Yijkl=μ+GEN1i+GEN2j+TYPEk+el中，Yijkl代表性狀觀察值；μ代表群體均數(shù)；GEN1i和GEN2j分別為C2744T 和C2866T 位點的基因型效應；TYPEk代表血漿中黑色素相關(guān)指標含量；el代表隨機誤差，假定服從(0，σ2)分布。根據(jù)上述模型，采用SAS 9.0 的GLM 過程進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果以“最小二乘法數(shù)±標準誤”表示。

熒光定量所得數(shù)據(jù)用Ratio=2-Ct(TYR)/2-Ct(β-actin)計算出目標基因表達。統(tǒng)計結(jié)果均以“平均值±標準誤”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 武定雞血漿黑色素指標含量分析

武定雞血漿黑色素指標的測定均使用ELISA試劑盒在酶標儀450 nm 波長條件下檢測所有試驗樣品(n=300 只)的光密度(OD 值) (所檢測標準曲線擬合度均大于0.99)。通過將酶標儀檢測所得的OD 值代入標準曲線得到兩組別的黑色素指標值 (表4)。通過比較分析發(fā)現(xiàn)：試驗組血漿中的TYR 活力、總黑色素含量以及血漿比色OD 值均高于對照組，其中試驗組血漿中的TYR 活力和總黑色素含量均極顯著高于對照組(P＜0.01)，血漿比色OD 值顯著高于對照組(P＜0.05)。

表4 不同黑色素指標之間的顯著性分析Tab.4 Significance analysis of different melanin indexes

2.2 TYR 基因多態(tài)性分析

2.2.1TYR基因測序結(jié)果分析

通過對TYR基因測序結(jié)果的分析，檢測到TYR-1引物上有2個SNPs：C2744T 和C2866T(圖2)。檢測得到的2 個突變位點，其突變均為同義突變，而其他外顯子區(qū)域引物均未檢測得到突變位點。

圖2 武定雞TYR 基因位點測序結(jié)果)Fig.2 Sequencing results of TYR gene locus in Wuding chicken

2.2.2TYR基因多態(tài)位點基因型和等位基因分析

對武定雞試驗組和對照組TYR基因各SNPs 位點進行群體遺傳學分析，并進行卡方檢驗Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。由表5 可知：武定雞兩組別所有檢測得到的TYR基因SNPs 位點(C2744T 和C2866T)均屬于中度多態(tài)(0.25＜P＜0.5)，并且所有突變位點都未偏離Hardy-Weinberg 平衡，2 個突變位點都出現(xiàn)3 種基因型。

表5 武定雞TYR 基因多態(tài)位點基因型及等位基因頻率Tab.5 Genotype and allele frequency of polymorphic sites of TYR genes in Wuding chicken

2.2.3TYR基因SNP 位點與武定雞黑色素相關(guān)指標含量的關(guān)聯(lián)分析

利用SAS 9.2 軟件將TYR基因所有突變位點的基因型和不同黑色素相關(guān)指標含量進行廣義線性模型(GLM)分析。由表6 可知：TYR 活力中，最高和最低分別都為C2744T位點的CC 基因型[(35.577±3.827) U/mL]和TT 基因型[(26.431±3.770) U/mL]；C2744T 位點的CC 基因型總黑色素含量與CT 基因型存在顯著差異(P＜0.05)，C2866T位點的CC 基因型總黑色素含量與CT 基因型呈極顯著差異(P＜0.01)，且含量最高為C2744T 位點的CC 基因型[(700.286±27.899) U/mL]，最低為C2866T 位點的CC 基因型[(312.208±15.475)U/mL]；通過不同多態(tài)位點基因型與血漿比色光密度均值關(guān)聯(lián)分析，C2744T 位點TT 基因型與CT 基因型呈顯著相關(guān)(P＜0.05)，其中血漿比色光密度均值最高為C2744T 位點的CT 基因型(0.370±0.020)。

表6 TYR 基因各突變位點不同基因型和武定雞黑色素相關(guān)指標含量關(guān)聯(lián)分析Tab.6 Association analysis of different genotypes at each mutation site of TYR gene and melanin related index content in Wuding chicken

2.3 TYR 基因表達量分析

利用熒光定量PCR 儀檢測武定雞不同組織中TYR基因的表達量。由圖3 可知：試驗組各組織TYR基因mRNA表達量均高于對照組，其中試驗組皮膚、腎臟、肝臟、心臟、肌胃和脾臟中的TYR基因mRNA表達量均極顯著高于對照組(P＜0.01)，而腿肌和胸肌中的TYR基因mRNA 表達量顯著高于對照組(P＜0.05)。此外，試驗組TYR基因mRNA 表達量的總體趨勢為皮膚＞腎臟＞肝臟＞心臟＞肌胃＞脾臟＞腿?。拘丶?。

圖3 武定雞各組織TYR 基因mRNA 的相對表達量)Fig.3 Relative expression of mRNA in different tissues of TYR gene in Wuding chicken

3 討論

3.1 血漿黑色素指標分析

TYR 是黑色素合成的第一限速酶，其活力決定著黑色素合成的產(chǎn)量、速度與種類，即真黑色素和褐黑色素的含量是由TYR 的活力來決定的，高活力的TYR 通過真黑色素的途徑合成產(chǎn)生真黑色素，反之低活力的TYR 則合成褐黑色素[10]。真黑色素的顏色是黑色或棕色，褐黑色素的顏色是黃色或微紅棕色[11]，烏骨雞黑色素屬于真黑色素[12]。本試驗測定武定雞血漿中黑色素相關(guān)指標含量，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：武定烏骨品系雞(試驗組)血漿中TYR 活力為(35.256±2.260) U/mL，極顯著高于對照組的(22.564±0.930) U/mL；血漿總黑色素含量也極顯著高于對照組(P＜0.01)，而血漿比色OD 值表現(xiàn)為試驗組顯著高于對照組(P＜0.05)。由此可見，TYR 活力與生成黑色素的含量成正比，本試驗結(jié)果也符合這一觀點，武定烏骨品系雞的血漿TYR 活力和總黑色素含量均極顯著高于對照組，以致使黑色素沉積所導致的肉、膚色較對照組更深，整體呈烏黑的性狀。而且，血漿比色的結(jié)果也符合這一現(xiàn)象，高活力的TYR導致烏骨品系雞合成顏色較深的真黑色素。真黑色素最后通過血液運輸至全身，最后可能導致武定烏骨品系雞的黑色素大量沉積呈現(xiàn)出烏質(zhì)性狀。本試驗所采用的檢測血漿中黑色素指標含量的方法鮮有研究，所以可為黑色素的相關(guān)研究奠定基礎。

3.2 TYR 基因多態(tài)性分析及其與黑色素沉積的關(guān)聯(lián)分析

烏骨雞作為保健食品頗受大眾喜愛，因為引起烏骨雞烏質(zhì)性狀的黑色素具有抗氧化和抗病性等作用[13]，因此利用分子遺傳學技術(shù)選育烏度更深的武定烏骨品系雞就顯得極為重要。本試驗通過擴增TYR基因的外顯子區(qū)，共找到2 個突變位點，其突變均為同義突變。最早人們認為同義突變不存在任何意義，但對其系統(tǒng)研究后發(fā)現(xiàn)：同義突變在生命活動中同樣起著非常重要的作用[14]。同義突變主要是通過RNA 的合成導致疾病的發(fā)生，例如編碼球蛋白基因外顯子的突變參與剪接位點的激活[15]。KOMAR 等[16]的研究得出：MDR1基因的C3435T 位點雖發(fā)生同義突變，但該突變不僅能夠改變機體內(nèi)部糖蛋白的構(gòu)象，而且還可以改變糖蛋白的活性及與底物結(jié)合的特異性，證明同義突變雖然具有相同氨基酸序列但會合成不同結(jié)構(gòu)和功能特性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。CHAO 等[17]研究表明：在人類苯基丙氨酸羥化酶基因cDNA 核苷酸序列1 197 位點處發(fā)生A 突變?yōu)門 的同義突變，雖是同義突變但該突變能夠誘導該基因外顯子11 轉(zhuǎn)錄后的跳躍，最終導致苯丙酮尿癥，因此說明同義突變對mRNA 轉(zhuǎn)錄和剪切造成影響。在兩組別中，2 個多態(tài)位點均呈現(xiàn)遺傳純合度較高、雜合度較低的情況，并且均呈中度多態(tài)。

在早期相關(guān)研究中，YANG 等[18]對5 種具有不同羽毛顏色(純黑羽、純灰羽、純白羽、水平斑羽和黑色斑點羽)的家雞進行了TYR基因第1 外顯子421 bp 片段的測序，研究表明：雞的羽毛顏色與TYR基因的遺傳變異有關(guān)。本研究對兩品系武定雞TYR基因的多態(tài)位點進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)2 個SNPs 位點(C2744T 和C2866T)均有3 種基因型。本試驗分析了其群體遺傳變異，研究結(jié)果豐富了武定雞TYR基因的SNP 標記，為進一步深入揭示基因多態(tài)性相關(guān)研究奠定了有益基礎。

張建勤等[19]采用PCR-SSCP 技術(shù)對國內(nèi)外多地雞種的TYR基因進行了遺傳變異研究，檢測所得突變位點C2866T 與本試驗結(jié)果相同，具備前人理論基礎。并且C2744T 位點的CC 基因型幾乎只存在于試驗組(烏骨品系雞)中，推測該位點的CC 基因型可能與武定烏骨品系雞的烏質(zhì)性狀形成有關(guān)。將兩組別武定雞的基因多態(tài)位點基因型與血漿黑色素指標進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明：TYR基因C2744T 位點的CC 基因型的血漿TYR活力均高于其他基因型，說明該突變位點的CC基因型可作為影響黑色素沉積的重要參考位點。

綜上所述，可以推測出TYR基因通過影響武定烏骨品系雞體內(nèi)的TYR 活力，導致黑色素含量不同，最終造成了黑色素沉積上的不同。

3.3 TYR 基因表達量的分析

有較多的研究[20-21]表明：TYR基因參與家雞的黑色素沉積過程。鄭嫩珠等[20]研究顯示：TYR基因在白絨烏骨雞皮膚、肝臟和肌肉等組織中的表達量與其黑色素含量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，TYR基因的高表達有利于促進烏骨雞黑色素沉積。杜曉明[21]研究顯示：黑色邊雞皮膚中TYR基因mRNA表達量顯著高于灰白色邊雞，羽髓中的TYR基因mRNA 表達量極顯著高于灰白色邊雞。本研究通過對烏骨品系(試驗組)和非烏骨品系(對照組)武定雞各組織中的TYR基因mRNA 相對表達量進行研究，發(fā)現(xiàn)TYR基因在試驗組和對照組胸肌、腿肌以及皮膚等組織中均有表達，其中試驗組各組織中TYR基因mRNA 表達量均高于對照組，且均存在顯著性差異；另外，試驗組各組織中TYR基因呈現(xiàn)皮膚＞腎臟＞肝臟＞心＞臟＞肌胃＞脾臟＞腿?。拘丶〉南鄬Ρ磉_量趨勢。該研究結(jié)果與鄭嫩珠等[22]研究類似，其對白絨烏骨雞各組織中TYR基因相對表達量進行研究，結(jié)果顯示為皮膚＞腎＞肌胃＞肝＞肌肉，除肝臟上的表達量不一致外，其他均與本試驗相符合。這可能是由于所選雞種、日齡或內(nèi)參基因不同所致。本研究結(jié)果表明：與對照組相比，試驗組各組織中高表達的TYR基因使其具有較高的黑色素沉積。由此可見，TYR基因是調(diào)控家雞黑色素生成的關(guān)鍵基因，在黑色素沉積中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

武定烏骨品系雞血漿TYR 活力、總黑色素含量以及血漿比色值均高于武定非烏骨品系雞，TYR基因外顯子中C2744T 的CC 基因型可能是影響武定雞烏質(zhì)性狀的潛在優(yōu)勢基因型，且武定烏骨品系雞的TYR基因表達量極顯著高于武定非烏骨品系雞。因此，可將TYR基因作為武定烏骨品系雞的黑色素沉積的分子標記基因運用于優(yōu)質(zhì)烏骨品系武定雞的分子育種。