關(guān) 熒，劉 楠，蒼 晶，魏鐵鎖，吳晶晶，齊 越，郭富燁，李沅珊

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，植物生理與分子生物學(xué)實(shí)驗室，黑龍江 哈爾濱 150000；2.北京卓誠惠生生物科技股份有限公司，北京 100000)

小麥?zhǔn)俏覈饕募Z食作物，東農(nóng)冬麥1號是首例能夠在黑龍江地區(qū)安全過冬的冬小麥品種，目前其體內(nèi)很多相關(guān)抗寒基因已被研究。

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor，TF)是已知響應(yīng)各種環(huán)境和發(fā)育線索來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的最重要的調(diào)節(jié)劑之一。人們對它們在減輕各種生物和非生物脅迫以及發(fā)育反應(yīng)中的作用進(jìn)行了深入研究。其中堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子代表最大和最多樣化的家族之一，并在真核生物中獨(dú)特存在。它參與真核生物的各種代謝途徑和應(yīng)激反應(yīng)。bZIP家族的明顯特征是存在一個基本的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域也負(fù)責(zé)核定位，與參與二聚化的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域相鄰。

植物bZIP蛋白通過與帶有ACGT核心順式元件的DNA序列結(jié)合，例如ABRE、G-box(CACGTG)、C-box(GACGTC)、A-box(TACGTA)、AAGCT(T box)和GCN4基序即TGA(G/C)TCA，從而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，參與多種非生物脅迫[1-6]。 bZIP蛋白在激素反應(yīng)、光信號傳導(dǎo)和光形態(tài)發(fā)生，種子發(fā)芽、成熟、花誘導(dǎo)和花發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用[7-10]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子在緩解各種生物和非生物脅迫以及發(fā)育反應(yīng)方面的作用已經(jīng)得到了很好的研究。如過表達(dá)TabZIP60的擬南芥植株對干旱、高鹽和低溫的抗性增強(qiáng)[11]；OsbZIP73與OsbZIP71相互作用并增強(qiáng)耐寒性[12]。在碳酸氫鹽堿性脅迫下，苜蓿中過表達(dá)GsbZIP67促進(jìn)了植物的生長[13]。番茄的SlbZIP38在不同器官中有差異表達(dá)，并且在干旱、鹽脅迫和脫落酸(ABA)的作用下表達(dá)下調(diào)[14]。谷子SibZIP8轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫中表達(dá)量顯著上調(diào)[15]。前期東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物分子與生理實(shí)驗室研究過TabZIP1在冬小麥內(nèi)抗寒性的研究，但是TabZIP2對強(qiáng)抗寒冬小麥抗寒性的影響則少有報道。

本研究首先對冬小麥中的TabZIP2基因進(jìn)行克隆，然后運(yùn)用生物信息學(xué)手段對其進(jìn)行分析，并且通過qRT-PCR技術(shù)對冬小麥TabZIP2基因在寒脅迫下ABA調(diào)控的逆境響應(yīng)進(jìn)行相對表達(dá)量分析，可為深入探究TabZIP2調(diào)控冬小麥的抗寒機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也可為揭示ABA調(diào)控信號的響應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2017年9月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田種植的強(qiáng)抗寒品種東農(nóng)冬麥1號以及弱抗寒品種濟(jì)麥22，在三葉期噴施ABA，并于5，0，-10，-25 ℃(連續(xù)10 d最低溫度平均值)，分別取樣分蘗節(jié)和葉片，并放于-80 ℃的冰箱進(jìn)行冷凍凍存[16]。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 在提取冬小麥分蘗節(jié)和葉片的RNA時都是采用試劑盒進(jìn)行提取。

1.2.2TabZIP的克隆 從東農(nóng)冬麥1號中PCR擴(kuò)增出TaZIP2的CDS序列(GenBank登錄號為KT224373.1)，PCR引物為Forward primer：5′-ATGGCATCGTCGCGGG-3′；Reverse primer：5′-CTACCATTCCATCGATTGGTC-3′。PCR程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃ 30 s；72 ℃ 10 min；4 ℃ ∞。利用膠回收試劑盒(購自康為世紀(jì))進(jìn)行目的條帶回收，并將其連接到pClone007 Vector載體(購自擎科生物)。之后將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5，并且篩選陽性克隆送至哈爾濱擎科生物公司進(jìn)行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)的分析 在對蛋白基本理化性質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)的分析時主要是使用PASy-ProtParamtool軟件進(jìn)行[17]；通過使用SOPMA程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；然后再使用ProtScale對蛋白質(zhì)的疏水區(qū)和親水區(qū)進(jìn)行在線程序預(yù)測；利用2.0版本的ClustalX和8.0版本的DNAMAN軟件對多序列比對進(jìn)行分析[18]；搜索時利用NCBI中的BlastP、構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹時使用MEGA 6.0軟件[19]；蛋白亞細(xì)胞定位的預(yù)測使用TargetP 1.1 Server，使用Ghlorop 1.1 Server對蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)行預(yù)測。

1.2.4 表達(dá)模式分析 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)為Mx-3000p Real-Time PCR system。根據(jù)已得到的TabZIP2基因為模板設(shè)計引物。TabZIP2轉(zhuǎn)錄因子Forward primer：5′-AATGGTAGAAGTATCCGCAAGC-3′；Reverse primer：5′-GAACTAGAGTCCTTCCGCCTAA-3′。以TaActin(GenBank登錄號352987)基因為內(nèi)參，F(xiàn)orward primer：5′-CCTTAGTACCTTCCAACAGATGT-3′；Reverse primer：5′-CCAGACAACTCGCAACTTAGA-3′。利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)對基因進(jìn)行RT-qPCR，PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，退火56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)；72 ℃ 1 min；4 ℃ ∞。利用公式2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。每個基因的表達(dá)分析均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，最后的數(shù)據(jù)用SPSS進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TabZIP2轉(zhuǎn)錄因子的克隆結(jié)果

分別以-10，-25 ℃的東農(nóng)冬麥1號分蘗節(jié)的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，Marker為2 000 bp，電泳圖中2個處理各呈現(xiàn)出1條759 bp的特異性條帶(圖1)，在獲得目的基因之后對其進(jìn)行膠回收，并使其連接到pClone007 Vector載體上，然后對形成的重組質(zhì)粒進(jìn)行大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化并挑選單菌落，接著將單菌落放到LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，搖菌進(jìn)行測序。利用DNAMAN軟件獲取序列并與已知序列比對，比對結(jié)果為2個序列基本一致，說明陽性重組體獲取成功。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1.-10 ℃時TabZIP2的PCR產(chǎn)物；2.-25 ℃時TabZIP2的PCR產(chǎn)物。M.DNA Marker DL2000；1.PCR product of TabZIP2 at -10 ℃ ；2.PCR product of TabZIP2 at -25 ℃.

2.2 TabZIP轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析

2.2.1 理化性質(zhì) 利用PASy-ProtParamtool對TabZIP轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)的預(yù)測，結(jié)果顯示：TabZIP2基因包含759 bp的完整開放閱讀框，其編碼的蛋白由252個氨基酸組成，分子式為C1118H1826N362O371S10，相對分子質(zhì)量為26.595 6 ku，理論等電點(diǎn)(PI)為5.5，不穩(wěn)定性系數(shù)(Instability index)為29.36(<40，蛋白穩(wěn)定)，脂肪族系數(shù)(Aliphatic index)為61.43，由此可以得出TabZIP2為弱酸性穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。

2.2.2 TabZIP2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SOPMA對TabZIP蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖2)，結(jié)果顯示TabZIP蛋白的α-螺旋(H)為130個，β-轉(zhuǎn)角(T)為6個，延伸片段(E)為14個，無規(guī)則卷曲(C)為102個；分別占總蛋白的51.59%，2.38%，5.56%，40.48%，其中α-螺旋(H)和無規(guī)則卷曲(C)占大部分。

圖2 TabZIP2蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.2 The second structure prediction of TabZIP2 protein

2.2.3 TabZIP2蛋白親水性和疏水性分析 在對TabZIP2蛋白親水性和疏水性進(jìn)行分析時，需要使用ProtScale在線程序來進(jìn)行預(yù)測和分析。一般情況下，TabZIP2蛋白親水性比較強(qiáng)時氨基酸的分值就會較低，TabZIP2蛋白疏水性比較強(qiáng)時氨基酸的分值就會較高。當(dāng)多肽鏈達(dá)到218和219位時，氨基酸分值是最低的為-3.656，這時蛋白的親水性是最強(qiáng)的；當(dāng)多肽鏈為103位時，氨基酸分值是最高的為1.533，這時蛋白的疏水性是最強(qiáng)的。由此可見，其疏水性氨基酸少于親水性氨基酸，因此，都是親水性蛋白質(zhì)(圖3)。

圖3 TabZIP2蛋白的親水性/疏水性預(yù)測分析Fig.3 Predictive analysis of hydrophilicity/hydrophobicity of TabZIP2 protein

2.2.4 TabZIP2蛋白的多序列比對結(jié)果 將TabZIP2與大麥(HordeumvulgareL.)、水稻(Oryzasativa)、黍(Panicumhallii)、高粱(Sorghumbicolor)的bZIP2蛋白開展多序列比對。其多序列比對結(jié)果表明，在TabZIP2蛋白中擁有一個堿性結(jié)構(gòu)域和一個亮氨酸拉鏈區(qū)域，其堿性結(jié)構(gòu)域是與DNA結(jié)合的，亮氨酸拉鏈區(qū)域具有二聚化作用(圖4)。

2.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹 用MEGA 6.0軟件對小麥與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、水稻、黍、高粱、玉米(Zeamays)、華東葡萄(Vitispseudoreticulata)、海棗(Phoenixdactylifera)、刺苞菜薊(Cynaracardunculus)的bZIP堿基序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明：二穗短柄草、水稻分為一組，TabZIP2的親緣關(guān)系與其較近；高粱、玉米和黍等單子葉植物為一組，即這些單子葉植物的bZIP聚類關(guān)系密切相關(guān)；華東葡萄、刺苞菜薊和海棗分為一組，TabZIP2的親緣關(guān)系與其較遠(yuǎn)(圖5)。

藍(lán)色下劃線部分表示N端是完整的堿性結(jié)構(gòu)域和C端是亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。The blue underlined part indicates that the N-terminus is a complete basic domain and the C-terminus is a leucine zipper domain.

圖5 9種植物的bZIP蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of bZIP proteins in 9 plants

2.2.6 TabZIP2蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測分析 在TargetP在線程序中輸入TabZIP2蛋白序列，然后應(yīng)用在線程序?qū)abZIP2蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測分析，其中52.6%的TabZIP2蛋白定位在細(xì)胞核中、36.9%的TabZIP2蛋白定位在細(xì)胞膜中、5.3%的TabZIP2蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中、9%的TabZIP2蛋白定位在其他部位，表明該蛋白亞細(xì)胞的定位是在細(xì)胞核中。使用Chlorop在線程序預(yù)測蛋白TabZIP2信號肽，結(jié)果為具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。

2.3 寒脅迫下東農(nóng)冬麥1號與濟(jì)麥22號TabZIP2在不同組織中的表達(dá)分析

定量結(jié)果顯示(圖6)，東農(nóng)冬麥1號分蘗節(jié)中TabZIP2的表達(dá)量在0 ℃時表達(dá)量降低，在-10 ℃時表達(dá)量上升并達(dá)到峰值，-25 ℃表達(dá)量又再次降低，但是高于5，0 ℃；與分蘗節(jié)相比，葉片中TabZIP2的表達(dá)量在0，-10 ℃時都顯著高于分蘗節(jié)，當(dāng)溫度在-10 ℃時達(dá)到最高水平，可見與分蘗節(jié)相比，葉片要比其提前應(yīng)答低溫脅迫。濟(jì)麥22分蘗節(jié)中TabZIP2的表達(dá)量先降低后恢復(fù)到5 ℃時的表達(dá)水平；葉片中TabZIP2表達(dá)量隨著溫度的降低呈先升高后降低趨勢，與東農(nóng)冬麥1號相同的是，在0，-10 ℃時葉片中TabZIP2的表達(dá)量也都顯著高于分蘗節(jié)，并且同樣在-10 ℃表達(dá)量最高。從總體來看，0 ℃以后，東農(nóng)冬麥1號分蘗節(jié)和葉片的TabZIP2表達(dá)量都較濟(jì)麥22的分蘗節(jié)和葉片表達(dá)量高。

不同小寫字母分別表示同一溫度下分蘗節(jié)與葉片差異在0.05水平上顯著。Different lower case letters indicate significant differences between the branching and the leaf at 0.05 at the same temperature.

2.4 ABA對不同溫度下東農(nóng)冬麥1號分蘗節(jié)和葉片TabZIP2表達(dá)的影響

TabZIP2表達(dá)量在經(jīng)過ABA處理后與對照組相比在分蘗節(jié)中表現(xiàn)為5 ℃下調(diào)、0 ℃上調(diào)，但差異不顯著(P>0.05)；-10 ℃上調(diào)表達(dá)，且差異顯著(P<0.05)。葉片中經(jīng)ABA處理后TabZIP2表達(dá)量變化趨勢與分蘗節(jié)相似，但表達(dá)量變化倍數(shù)小于分蘗節(jié)(圖7)。

3 討論與結(jié)論

對于真核生物來講，轉(zhuǎn)錄調(diào)控?zé)o論在生物的生長發(fā)育中，還是在信號傳導(dǎo)上，又或是逆境的響應(yīng)上都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的一系列發(fā)育過程和脅迫反應(yīng)。前人研究表明，很多bZIP轉(zhuǎn)錄因子在從幼苗到植株的各種組織中都有表達(dá)。bZIPs的這種組織特異性表達(dá)證實(shí)了之前在小麥的研究中，如TabZIP1在冬小麥中隨著溫度的降低分蘗節(jié)中該基因的表達(dá)量大于葉片[20]；TaABP1受到ABA、高鹽、低溫和干旱的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，其在莖和葉中的表達(dá)均強(qiáng)于小麥的根[21]。本試驗表明，TabZIP2在分蘗節(jié)和葉片中均有表達(dá)，且不同溫度下表達(dá)量存在差異?？傮w表現(xiàn)為在-10 ℃時TabZIP2在東農(nóng)冬麥1號和濟(jì)麥22的分蘗節(jié)和葉片中表達(dá)量隨著溫度的降低逐漸升高；但-25 ℃時分蘗節(jié)的表達(dá)量高于葉片?？梢?，葉片要比分蘗節(jié)提前應(yīng)答低溫。同時分蘗節(jié)和葉片都是在-10 ℃時TabZIP2的表達(dá)量處于峰值的狀態(tài)，而這一觀點(diǎn)與前期本實(shí)驗室驗證的冬小麥東農(nóng)冬麥1號開啟抗寒機(jī)制的關(guān)鍵溫度點(diǎn)就是-10 ℃的結(jié)論相一致[22]。而0 ℃以后，東農(nóng)冬麥1號分蘗節(jié)和葉片的TabZIP2表達(dá)量都較濟(jì)麥22的分蘗節(jié)和葉片表達(dá)量高。因此得出結(jié)論，TabZIP2的組織特異性表達(dá)在不同的小麥品種中表現(xiàn)出不同的表達(dá)譜，因此，初步判定TabZIP2的表達(dá)量變化情況能夠作為小麥抗寒性強(qiáng)弱的判斷指標(biāo)。

不同小寫字母表示ABA處理與對照差異在0.05水平上顯著。Different lowercase letters indicate ABA treatment and CK at 0.05 level.

本研究對噴施外源ABA條件下東農(nóng)冬麥1號分蘗節(jié)以及葉片的TabZIP2表達(dá)量與對照組進(jìn)行了比較分析，揭示了它們在低溫脅迫條件下的差異表達(dá)。結(jié)果表明，寒脅迫下ABA處理能誘導(dǎo)TabZIP2基因的上調(diào)表達(dá)。這種反應(yīng)可能是由于其啟動子區(qū)存在脫落酸反應(yīng)元件。研究表明，一組重要的順式反應(yīng)元件在其1 kb上游區(qū)域中被識別，主要包括脫落酸、生長素、乙烯和赤霉素的反應(yīng)元件[23]。但在5，0 ℃時噴施ABA的分蘗節(jié)和葉片中TabZIP2的表達(dá)量沒有明顯變化，這可能是5，0 ℃時ABA處理過的東農(nóng)冬麥1號幼苗中的TabZIP2還未對寒冷做出應(yīng)答。0 ℃以下，隨著溫度的降低，寒脅迫和外源ABA共同作用，促進(jìn)了TabZIP2上調(diào)表達(dá)。許多研究表明，脫落酸(ABA)參與調(diào)控植物的非生物脅迫。如小麥中TabZIP14-B在根、莖、葉和幼穗中表達(dá)，并通過外源ABA、鹽、低溫和聚乙二醇(PEG)脅迫處理上調(diào)[24]。AtbZIP1可以通過與ABRE元件結(jié)合調(diào)節(jié)植物對ABA處理的敏感性和下游ABA響應(yīng)基因的表達(dá)，從而參與植物的ABA信號傳導(dǎo)通路[25]。

本研究首先克隆了東農(nóng)冬麥1號中TabZIP2基因，之后以生物信息學(xué)手段為輔助，通過qRT-PCR技術(shù)對TabZIP2在寒脅迫下ABA調(diào)控的逆境響應(yīng)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：東農(nóng)冬麥1號分蘗節(jié)和葉片中的TabZIP2表達(dá)量高于濟(jì)麥22；ABA能夠正向調(diào)節(jié)TabZIP2的表達(dá)，初步判斷從而提高冬小麥的抗寒性。本研究初步探究了TabZIP2在東農(nóng)冬麥1號抗寒方面發(fā)揮的功能，也為低溫下ABA信號調(diào)控機(jī)制提供了信息支持。