史 娟，李永麗，常 樂 ，鄭煒凡，周 洲，曲良建

(1.河南科技大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.信陽農(nóng)林學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，河南 信陽 464000；3.中國林業(yè)科學(xué)研究院 森林生態(tài)環(huán)境與森林保護(hù)研究所,國家林業(yè)和草原局森林保護(hù)重點實驗室，北京 100091)

鏈霉菌 (Streptomyces)可產(chǎn)生多種對植物病原菌有拮抗作用的次生代謝產(chǎn)物，很多鏈霉菌已經(jīng)被開發(fā)用于植物病害生物防治[1-11]。內(nèi)生鏈霉菌可分布于植物的根、莖、葉、果實及種子中，具有很高的應(yīng)用價值。河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院林業(yè)生物技術(shù)實驗室前期從新疆野蘋果枝干中分離得到一株內(nèi)生具生防作用的鏈霉菌菌株 A-m1，其發(fā)酵濾液抑菌譜較廣、抑菌活性高，具有防治部分作物真菌性病害的應(yīng)用潛力[12]；同時還發(fā)現(xiàn)，菌株A-m1發(fā)酵液抑菌活性與其色素產(chǎn)生具有同步現(xiàn)象，后經(jīng)基因組測序比對，最終鑒定該菌株屬于哥斯達(dá)黎加鏈霉菌(Streptomycescostaricanus)。

研究發(fā)現(xiàn)，一些哥斯達(dá)黎加鏈霉菌菌株對植物生長具有促進(jìn)作用，如菌株RP92從污染的土壤中分離得到，能顯著促進(jìn)雀稗草 (Tagetespatula)的生長，并且有效減輕由于化學(xué)污染對植物產(chǎn)生的毒害作用[13]；菌株HR391從土壤中分離得到，對香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌 (Fusariumoxysporum)和立枯絲核菌 (Rhizoctoniasolani)有防治效果，并能產(chǎn)生一些促進(jìn)植物生長的激素[14]；從土壤中分離得到的菌株CR-43不僅對土壤中的線蟲具有致死性，同時還能夠減少辣椒 (Capsicumannuum)和番茄 (Lycopersiconesculentum)植株根際脫落[15]。菌株A-m1具有作為優(yōu)良生防菌劑開發(fā)應(yīng)用的潛力，其對植物是否具有促生作用，對其進(jìn)一步開發(fā)產(chǎn)品及擴(kuò)大其應(yīng)用范圍具有重要意義。因此，以番茄幼苗為研究對象，首先明確菌株A-m1具有的促生作用，然后對菌株A-m1進(jìn)行基因組分析，再明確其促生作用的遺傳基礎(chǔ)，并生化驗證促生作用相關(guān)產(chǎn)物的表達(dá)情況，為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

哥斯達(dá)黎加鏈霉菌菌株A-m1，由本實驗室從新疆野蘋果枝干中分離并保存[12]。固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)成分是大米∶高粱∶米糠∶稻殼=2∶2∶3∶3(m/m)，初始水料比為1.7∶1.0(V/m)。供試番茄品種為中蔬4號。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株A-m1的培養(yǎng) 按照菌株A-m1優(yōu)化的發(fā)酵條件[12]，液體搖瓶發(fā)酵4 d獲得新鮮發(fā)酵液。在200 mL玻璃瓶中添加固體發(fā)酵基質(zhì)20 g，接種新鮮發(fā)酵液2 mL，于28 ℃培養(yǎng)10 d，孢子含量為108個/g。

1.2.2 菌株A-m1固體發(fā)酵產(chǎn)物對番茄幼苗促生作用分析 向2 kg泥炭土育苗基質(zhì)中分別添加1.2.1中培養(yǎng)的菌株A-m1固體發(fā)酵物 20，40，60，80 g，4個處理分別記作組1、組2、組3、組4；空白對照添加20 g無菌的固體發(fā)酵基質(zhì)，記作CK。所有基質(zhì)加水至適宜播種含水量，充分混勻，裝袋保濕孵育2 d后裝育苗穴盤。

挑選發(fā)育良好的番茄種子放入40 ℃溫水中浸泡，待種子吸水膨脹后擺放在鋪有無菌濾紙片的培養(yǎng)基中，加水保濕，于28 ℃放置48 h。待種子發(fā)芽長至根長1～2 cm，挑選生長一致的小苗播種穴盤內(nèi)(1株/穴)，每個處理16株，重復(fù)3次。覆土深度1 cm，適時澆水保持基質(zhì)濕潤，置于室外正常培養(yǎng)。培養(yǎng)16 d時測量葉片長度、地上部株高、植株根長、SPAD、整株鮮質(zhì)量、整株干質(zhì)量、根干質(zhì)量以及莖稈直徑。其中，葉長、株高和根長利用刻度尺測量，SPAD值含量使用葉綠素儀TYS-4N(北京，中科維禾科技公司)測量植株第一片真葉的葉綠素，番茄幼苗去除根部土壤后電子天平稱量，莖稈直徑用游標(biāo)卡尺測量番茄幼苗緊挨地表的莖稈處的直徑。采用Excel 2010和SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

1.2.3 菌株A-m1全基因組測序 將純化的菌株A-m1送往北京百邁克公司通過三代Nanopore測序儀進(jìn)行全基因組測序。通過與Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，找到在Nr數(shù)據(jù)庫中最相似的序列，完成測序基因組基因的注釋[16]。

1.2.4 菌株A-m1產(chǎn)IAA分析 IAA檢測培養(yǎng)基和Salkowski′s顯色劑配制均參照文獻(xiàn)[17]中的方法。將無菌色氨酸溶液加入IAA檢測培養(yǎng)基中，使色氨酸的質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL，再將培養(yǎng)好的菌株A-m1發(fā)酵液按7%的接種量接種于IAA檢測培養(yǎng)基中，置于28 ℃、180 r/min 搖床中培養(yǎng)，每隔24 h取一次樣，連續(xù)取6次，將發(fā)酵液置于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液與等量的Salkowski′s顯色劑混合均勻，暗反應(yīng)20 min，若溶液顯粉紅色，則說明菌株A-m1能產(chǎn)生IAA，以IAA檢測培養(yǎng)基為對照，測定OD530值。IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配制1 g/L的IAA母液，將其稀釋為0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/L等不同質(zhì)量濃度，分別與Salkowski′s顯色劑暗反應(yīng)20 min，以無菌水為對照，測定OD530值，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD530值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中IAA的質(zhì)量濃度。

1.2.5 菌株A-m1產(chǎn)鐵載體分析 采用鉻天青(Chromatography CAS)檢測法測定菌株A-m1產(chǎn)鐵載體活性，將濾紙片用塑料鑷子放在CAS檢測培養(yǎng)基上，每個濾紙片上滴2 μL發(fā)酵液，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察濾紙片周圍是否有黃色透明暈圈，并測定暈圈的直徑，計算暈圈直徑與濾紙片直徑的比值，用于表示菌株產(chǎn)鐵載體的活性大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株A-m1對番茄幼苗的促生作用

番茄苗生長16 d，各組第一片真葉長度(圖1-A)、株高(圖1-B)、整株鮮質(zhì)量(圖1-C)、整株干質(zhì)量(圖1-D)、根干質(zhì)量(圖1-E)和莖稈直徑(圖1-F)這6項指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果都是一致的，4個處理組均顯著大于CK，且組4顯著大于組1、組2和組3。其中，CK葉長為2.61 cm，組1、組2、組3和組4與CK相比分別提高了20.6%，16.5%，17.2%，107.1%。CK株高為3.36 cm，4個處理組與CK相比分別提高了17.9%，18.4%，27.2%，70.7%。CK 整株鮮質(zhì)量為0.18 g，干質(zhì)量為16.3 mg，根干質(zhì)量為2.93 mg，4個處理組整株鮮質(zhì)量與CK相比分別提高了63.9%，38.9%，62.9%，439.9%，整株干質(zhì)量分別提高了83.2%，105.3%，87.1%，427.4%，根干質(zhì)量分別提高了104.8%，111.1%，150.8%，473.4%。CK莖稈直徑為1.51 mm，4個處理組與CK相比分別提高了12.3%，9.2%，15.4%，78.7%。說明菌株A-m1對番茄幼苗葉片、株高、生物量和莖稈直徑有顯著的生長促進(jìn)作用，促生作用與菌體含量有關(guān)，有利于培養(yǎng)番茄壯苗。

圖中小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3同。The difference of small letters is significant(P<0.05). The same as Fig.3.

番茄苗生長16 d時，SPAD值統(tǒng)計見圖1-G。組1、組2和組3的番茄葉片SPAD值分別為31.04，29.84，30.44，CK番茄葉片SPAD值為30.69，組1、組2、組3與CK不存在顯著差異，組4番茄葉片SPAD值僅為24.79，顯著低于CK和另外3個試驗組。以上結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是，菌株A-m1導(dǎo)致番茄生長加速，而穴盤內(nèi)基質(zhì)較少，氮素等元素短時間供應(yīng)不足，引起番茄葉片的SPAD值含量暫時減少。

番茄苗生長16 d時，根長統(tǒng)計見圖1-H。CK、組1、組2、組3、組4中根長分別為11.35，15.28，14.93，14.65，13.38 cm，統(tǒng)計表明，4個試驗組植株根長均顯著大于CK，組1與組4差異顯著，組2、組3與組4間不存在顯著差異。根長最大是菌體含量不太高的組1，菌體最高的組4其根長在4個試驗組中最小，同時發(fā)現(xiàn)其須根數(shù)量較多。

2.2 菌株A-m1全基因組分析

菌株A-m1經(jīng)測序組裝，基因組全長為8 532 264 bp，包含一個線性染色體。全基因組在GenBank中的登錄號為CP066774?；蚪MGC含量為71.81%，預(yù)測編碼7 477個基因，平均長度1 014 bp，編碼序列占整個基因組序列的88.90%。

基因注釋分類統(tǒng)計結(jié)果顯示，菌株A-m1編碼有促進(jìn)植物生長的相關(guān)基因，這些基因所分布的位置見圖2。A-m1能夠編碼吲哚乙酸(IAA)(GE 001036)、細(xì)胞分裂素(GE 001249、GE 001606)等植物激素。也可以編碼一些直接或間接促進(jìn)植物生長的酶，如ACC脫氨酶(GE 001358、GE 003235)、植酸酶(GE 006609、GE 003625、GE 000591)可以直接作用于植物，促進(jìn)植物的生長；鐵載體(GE 001092、GE 002359、GE 002360、GE 003211、GE 003212、GE 005853、GE 006636)可以與土壤中不易被植物利用的Fe3+結(jié)合形成復(fù)合物，增強(qiáng)植物對鐵離子的吸收，促進(jìn)植物的生長；磷酸酶(GE 000014、GE 000030、GE 000039、GE 000117、GE 000598、GE 000605)、固氮酶(GE 005760、GE 006065、GE 006099)可以間接地促進(jìn)植物的生長，磷酸酶可以溶解土壤中一些難溶的磷酸鹽，增強(qiáng)植物對磷離子的吸收，而固氮酶可以將空氣中的無機(jī)氮源轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)氮源，增強(qiáng)植物對氮素的吸收，促進(jìn)植物的生長。

磷酸酶、吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素、鐵載體、ACC脫氨酶、植酸酶、固氮酶在基因組上分布的位置標(biāo)注在最外圈相對位置。最外面一圈為基因組大小的標(biāo)示，每個刻度為5 kb；第2圈和第3圈分別為基因組正鏈和負(fù)鏈上的基因，不同顏色代表不同的COG功能分類；第4圈為重復(fù)序列；第5圈為tRNA和rRNA，藍(lán)色為tRNA，紫色是rRNA；第6圈為GC含量，淺黃色部分表示該區(qū)域GC含量高于基因組的平均GC含量，峰值越高則與平均GC含量差異越大，藍(lán)色部分則表示該區(qū)域GC含量低于基因組的平均GC含量；最內(nèi)圈是GC-skew，深灰色代表G含量大于C的區(qū)域，紅色代表C含量大于G的區(qū)域。

2.3 菌株A-m1產(chǎn)IAA動態(tài)

試驗中制作了IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為：y=0.028 5x+0.002 4，R2=0.994 2。將菌株A-m1接種到IAA檢測培養(yǎng)基中，離心取上清液與Salkowski′s顯色劑暗反應(yīng)20 min，結(jié)果顯示粉紅色(圖3-A)，說明菌株A-m1能產(chǎn)IAA。將菌株A-m1接種到IAA檢測培養(yǎng)基中，連續(xù)6 d取樣，隨著培養(yǎng)時間的不同，產(chǎn)IAA的量發(fā)生了變化(圖3-B)。菌株A-m1在培養(yǎng)第2天時，產(chǎn)IAA能力達(dá)到最高，為1.036 7 mg/L，與其他5 d差異顯著(P<0.05)；其余培養(yǎng)天數(shù)的IAA產(chǎn)量處于同一水平。

2.4 菌株A-m1產(chǎn)鐵載體活性檢測

菌株A-m1在CAS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落周圍的藍(lán)色逐漸變?yōu)槌赛S色透明暈圈(圖3-C)，說明菌株可以產(chǎn)生具有螯合鐵能力的鐵載體，奪取CAS培養(yǎng)基中游離的鐵離子，使菌落周圍的藍(lán)色變?yōu)槌赛S色透明暈圈。5 d后，暈圈的直徑與濾紙片的直徑比值為1.4(圖3-D)。

A.菌株A-m1發(fā)酵液與Salkowski′s的顯色反應(yīng)：1-3.處理組;4.對照組；B.菌株A-m1產(chǎn)IAA趨勢圖；C.菌株A-m1在CAS培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)；D.暈圈與濾紙片直徑比值的變化圖。A.Reaction of A-m1 fermentation broth with Salkowski′s chromogenic agent：1-3.Treatment group；4.Control group；B.Dynamic trend of IAA production by strain A-m1；C.Growth state of A-m1 strain on CAS culture medium；D.The change chart of diameter ratio of halo to filter paper.

3 結(jié)論與討論

鏈霉菌是一類重要的植物微生物資源，不僅對植物病害具有較好的防治效果，還對植物生長具有較好的促進(jìn)作用，已有研究表明鏈霉菌對一些植物具有促生效果，主要表現(xiàn)在提高種子的發(fā)芽率，增加植物株高、根長、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量以及葉綠素含量，且鏈霉菌的促生效果與其使用濃度有關(guān)[18-24]。

研究報道，鏈霉菌菌株NEAU-D1、菌株D74對番茄幼苗株高、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量有促生作用[25-26]。本試驗中，菌株A-m1對番茄幼苗同樣表現(xiàn)出明顯促生作用，但菌株A-m1對番茄幼苗株高、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等指標(biāo)表現(xiàn)出的促生作用更強(qiáng)。全基因組測序表明，菌株A-m1具有產(chǎn)生促生作用的一些基因，如生長素、細(xì)胞分裂素、鐵載體、ACC脫氨酶、植酸酶、磷酸酶、固氮酶相關(guān)基因，這從遺傳基礎(chǔ)上解釋了菌株A-m1促生作用產(chǎn)生的原因。

通過對菌株A-m1發(fā)酵液進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)菌株A-m1具有產(chǎn)IAA的能力。在4組不同濃度番茄苗促生試驗中，組4的高菌體含量對番茄幼苗株高、葉片、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量以及莖稈直徑的促進(jìn)作用最顯著；同時也發(fā)現(xiàn)，組4的根長在處理組中最短，但其須根數(shù)量最豐富。李威等[27]用菌株XL-6不同濃度的發(fā)酵液處理茄苗試驗中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液高濃度沒有低濃度的促生效果顯著，這與本研究中的結(jié)果有部分相似。分析本試驗中番茄苗促生原因可能是激素作用的結(jié)果，A-m1固體發(fā)酵基質(zhì)中激素類物質(zhì)對植物的生長造成影響，如IAA在植物的生長中存在閾值，植物的不同部位對其需求量不同，IAA對植物根部表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)生長，高濃度抑制生長。

鐵載體可以與土壤中不易被植物利用的Fe3+結(jié)合形成復(fù)合物，增強(qiáng)植物對鐵離子的吸收，促進(jìn)植物的生長[28-30]。經(jīng)生化分析，菌株A-m1產(chǎn)鐵載體的能力得到驗證，這與Kim等[14]對菌株HR391促生機(jī)理的研究結(jié)果相一致。菌株A-m1具有潛在的固氮和溶磷等促進(jìn)植物生長作用，試驗條件下這些潛在的相關(guān)基因表達(dá)情況如何還有待進(jìn)一步的研究。

哥斯達(dá)黎加鏈霉菌是重要的一種微生物資源，其抑菌活性、殺蟲活性、促進(jìn)植物生長和降解纖維素的能力在國內(nèi)外一些研究中有零星報道[31-34]，且已報道的對象均來自土壤和海洋環(huán)境，但有關(guān)植物內(nèi)生哥斯達(dá)黎加鏈霉菌促生作用及遺傳基礎(chǔ)研究尚未見報道。本研究中從新疆野蘋果分離獲得的內(nèi)生菌株A-m1，前期通過細(xì)菌的形態(tài)特征、生理生化特征及16s rDNA序列分析初步鑒定為婁徹氏鏈霉菌，后經(jīng)全基因組測序分析，修正為哥斯達(dá)黎加鏈霉菌。本試驗以菌株A-m1為研究對象，通過測定番茄幼苗生理指標(biāo)驗證了菌株A-m1的促生作用，全基因組分析表明菌株A-m1的促生作用可通過產(chǎn)生生長素、細(xì)胞分裂素、鐵載體、ACC脫氨酶、植酸酶、磷酸酶、固氮酶等方式實現(xiàn)，解析了其促生作用產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)，為其在植物促生方面的功能開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。