李默曉，卞 哲，周啟慧，劉玉衛(wèi)，鞏校東，谷守芹，韓建民

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001)

玉米大斑病是由病原真菌引起的玉米葉部病害，受病菌侵染后植株葉片先出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，之后沿葉脈向兩端擴(kuò)展形成典型梭狀病斑，嚴(yán)重影響葉片光合作用[1-3]。其致病真菌為玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)，在高濕度及中等溫度條件下發(fā)生，感病品種嚴(yán)重感染時(shí)可致作物減產(chǎn)達(dá)50%以上，甚至絕收[4]。由于玉米大斑病菌變異頻繁，導(dǎo)致玉米大斑病的發(fā)病呈逐年上升的趨勢。因此，從分子水平上解析玉米大斑病菌生長發(fā)育及致病的分子機(jī)理已經(jīng)成為該病害綜合防治的基礎(chǔ)研究之一。

前人研究表明，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)線粒體在細(xì)胞衰老過程中扮演重要角色，線粒體通過產(chǎn)生活性氧導(dǎo)致細(xì)胞衰老[5]。然而，線粒體在衰老過程中的作用遠(yuǎn)不止于此，在衰老過程中積累的線粒體功能障礙引發(fā)逆行反應(yīng)，這種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路可激活彌補(bǔ)這種功能障礙的基因[6]，而ScRtg2蛋白是線粒體逆行信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白[7-8]。研究表明，酸脅迫通過Hog1激活觸發(fā)對乙酸誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的抗性，這需要酵母中的ScRtg2蛋白，且這個(gè)過程是獨(dú)立于依賴Rtg1/3的線粒體逆行信號(hào)通路的[9]。酵母中存在從線粒體到細(xì)胞核的通訊路徑，這個(gè)途徑需要2個(gè)酵母基因ScRTG1和ScRTG2[10-11]。迄今為止，關(guān)于玉米大斑病菌中RTG2同源基因功能的研究未見報(bào)道。

河北省植物生理及分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在玉米大斑病菌中存在3條MAPK(Mitogen activated protein kinase)通路[12]，其中HOG-MAPK途徑與調(diào)控植物病原真菌應(yīng)對高滲脅迫相關(guān)，而StHOG1基因是該途徑的關(guān)鍵基因[13-14]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，該途徑關(guān)鍵基因StHOG1通過StRTG1/3間接調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子StMSN2。本研究擬在玉米大斑病菌數(shù)據(jù)庫中搜索RTG2-like基因StRTG2的DNA基因組序列和cDNA序列，利用生物信息學(xué)分析其基因結(jié)構(gòu)以及蛋白空間結(jié)構(gòu)特征；構(gòu)建該基因原核表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21中進(jìn)行StRTG2基因的原核表達(dá)；同時(shí)分析病菌5個(gè)重要發(fā)育時(shí)期(菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘)的RNA-Seq基因組數(shù)據(jù)庫，明確該基因的表達(dá)模式。該研究可為進(jìn)一步分析StRTG2基因的功能以及其與StHOG1的互作關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

玉米大斑病菌野生型菌株01-23由河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。高保真PCR Mix(諾維贊2×Rapid Taq Master Mix)、克隆載體pMD-19T、小型質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Mini Kit Ⅰ，OMEGA bio-tek)T4-DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶(QuickCutKPNⅠ，EcoR Ⅰ，TaKaRa)、大腸桿菌感受態(tài)(DH5α)、大腸桿菌感受態(tài)(BL21)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物科技公司；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、A0120-便捷型植物RNA快速提取試劑盒購自天津華力科析科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒M5 Superpius qPCR RT with gDNA removor購自北京聚合美生物技術(shù)有限公司；Blue Plus V Protein Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 玉米大斑病菌StRTG2的鑒定

利用酵母基因組數(shù)據(jù)庫SGD(https：//www.yeastgenome.org/)查找ScRtg2氨基酸序列；在玉米大斑病菌基因數(shù)據(jù)庫JGI(https：//mycocosm.jgi.doe.gov/)中進(jìn)行BlastP，搜索其同源的氨基酸序列及其蛋白ID，在JGI中搜索蛋白ID獲得DNA及cDNA序列。根據(jù)其序列設(shè)計(jì)兩端引物(StRTG2-F：ATGGTTACGACAAACGAGTCACGACACC；StRGT2-R：TCACTCGGAGCCGTATGCCTCGCCATTCA)。分別以玉米大斑病菌01-23的全基因DNA以及cDNA為模板，利用高保真MIX進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為引物StRTG2-F、StRGT2-R各2 μL，2×Rapid Taq Master Mix 25 μL，cDNA/DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 2min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，16 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在照膠儀下進(jìn)行比對觀察。

1.3 玉米大斑病菌StRTG2結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

使用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam)預(yù)測蛋白理化性質(zhì)，利用Prab(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)預(yù)測蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[15-16]。利用在線網(wǎng)站HMMER (https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)分析StRtg2的功能結(jié)構(gòu)域。利用MEGA 7.0建立不同物種中的RTG2的系統(tǒng)進(jìn)化樹[17]。

1.4 玉米大斑病菌不同發(fā)育時(shí)期材料的收集及RNA-Seq數(shù)據(jù)分析

選取玉米大斑病菌5個(gè)典型的發(fā)育時(shí)期(菌絲、分生孢子、芽管、附著胞、侵入釘)，分別采用如下方法收集材料。菌絲時(shí)期：選取在PDA上25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d左右的野生型菌株，用去尖藍(lán)槍頭傾斜刮取菌絲體。分生孢子時(shí)期：選取PDA上25 ℃黑暗培養(yǎng)15 d左右的玉米大斑病菌，用棉簽刮去其氣生菌絲，將剩余基生菌絲繼續(xù)培養(yǎng)3 d，加入8 mL左右無菌水，小心晃動(dòng)使ddH2O覆蓋整個(gè)皿面后，收集分生孢子懸浮液，12 000 r/min離心，獲得分生孢子。芽管、附著胞及侵入釘時(shí)期：在覆蓋有玻璃紙的水瓊脂培養(yǎng)基上加入分生孢子懸浮液后黑暗培養(yǎng)4 h后收集芽管，10 h后收集附著胞；16 h后收集侵入釘。以上試驗(yàn)樣品需要設(shè)置3次重復(fù)。將以上材料送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行RNA-Seq分析。利用本實(shí)驗(yàn)室獲得的玉米大斑病菌RNA-Seq數(shù)據(jù)庫，分析StRTG2在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式。

1.5 玉米大斑病菌StRTG2在大腸桿菌BL21(DE3)中的原核表達(dá)

以玉米大斑病菌野生型01-23 cDNA序列為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(StRtg2-L：GGTACCATGGTTACGACAAACGAGTCACGACACCTGCA；StRtg2-R：GAATTCTCACTCGGAGCCGTATGCCTCGCCATTCACCGTCAC)，下劃線部分分別為限制性內(nèi)切酶KPNⅠ和EcoRⅠ的內(nèi)切酶識(shí)別部位?；厥瞻康钠蔚沫傊悄z進(jìn)行膠回收后，將回收產(chǎn)物連接至pMD19-T轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5α，利用氨芐抗性篩選后，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR，將條帶正確的菌液送至生工進(jìn)行測序。用兩端限制性內(nèi)切酶KPNⅠ和EcoRⅠ將測序正確的片段從pMD19-T酶切下來并用T4-連接酶連接至原核表達(dá)載體pET-30a上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，利用卡那霉素抗性進(jìn)行篩選。利用PCR驗(yàn)證陽性菌落，將正確連接的質(zhì)粒命名為pET30a-StRTG2，提取質(zhì)粒對其進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

將質(zhì)粒pET30a-StRTG2轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，加入LB培養(yǎng)基后37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h，將菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上(100 μg/mL的卡那霉素)，37 ℃過夜培養(yǎng)12 h，挑取陽性單克隆菌落，轉(zhuǎn)接于30 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，作為種子液保存至4 ℃。取20 μL種子液于20 mL 2×YT培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)至波長在600 nm的吸光度值為0.6左右，加入IPTG至終濃度為1 mol/L，37 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h[18]。分別取1 mL誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的菌液于1.5 mL Ep管中，13 000 r/min離心10 min，保留沉淀。將沉淀用150 mL水重懸后吸取24 μL菌體于新Ep管，加入6 μL的5×上樣Buffer?；靹蚝髮悠贩兴?0 min，11 000 r/min離心10 min后，吸取上清，加入點(diǎn)樣孔內(nèi)，利用SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米大斑病菌StRTG2基因的克隆

在釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫中搜索ScRtg2蛋白質(zhì)序列，將其在玉米大斑病菌數(shù)據(jù)庫(JGI)中進(jìn)行BlastP，得到了1個(gè)ScRtg2的同源序列，其蛋白ID號(hào)為33837；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該基因位于病菌基因正鏈scaffold_5的1 994 979-1 996 673位置，將該基因命名為StRTG2。 分別以玉米大斑病菌的DNA、cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了長度約為1 700 bp的擴(kuò)增片段(圖1)，結(jié)果符合預(yù)期。將兩片段瓊脂糖凝膠進(jìn)行回收，送至公司進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其DNA、cDNA全長均為1 695 bp，不含有內(nèi)含子。

M.DNA Marker (100～5 000 bp)；圖A中泳道1、2、3均為StRTG2基因以玉米大斑病菌野生型01-23的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物；圖B中泳道1、2、3均為StRTG2基因以玉米大斑病菌野生型01-23 cDNA序列為模板進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物。

2.2 玉米大斑病菌StRtg2的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位及其高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

生物信息學(xué)分析表明，StRTG2基因所編碼的蛋白由564個(gè)氨基酸組成，其相對分子質(zhì)量為62.069 44 ku，理論等電點(diǎn)值(pI)是6.96。在編碼的氨基酸中，丙氨酸(Ala)含量最高，所占比例是9.4%；其中帶負(fù)電的殘基數(shù)量為59，帶正電的殘基數(shù)量為58。結(jié)果還顯示，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為37.15，由此推測其為穩(wěn)定蛋白。該蛋白親水系數(shù)為-0.205，說明該蛋白為親水性蛋白。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明，該蛋白1-564位氨基酸均位于細(xì)胞膜外，屬于非跨膜蛋白。對其亞細(xì)胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在27個(gè)最鄰近成員中，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、過氧化物酶體中均有分布，根據(jù)結(jié)果分析得到，該蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)中的可能性比較大。

對StRtg2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白的237個(gè)氨基酸構(gòu)成α螺旋結(jié)構(gòu)，占比為45.02%；81個(gè)氨基酸構(gòu)成延伸鏈，占比為14.36%；246個(gè)氨基酸構(gòu)成無規(guī)則卷曲，占比為43.62%。對其結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)StRtg2蛋白中的25-342位氨基酸構(gòu)成Ppx-Gppa結(jié)構(gòu)域，358-368位氨基酸和489-500位氨基酸形成低復(fù)雜區(qū)域。對StRtg2的功能結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，StRtg2具有典型的Ppx-Gppa保守結(jié)構(gòu)域(即結(jié)構(gòu)域)，該家族由外切磷酸酶(Ppx)的N末端以及EC：3.6.1.11和鳥苷五磷酸磷酸水解酶(GppA)EC：3.6.1.40組成(圖2)。

圖2 StRtg2功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Functional domain analysis of StRtg2

對StRtg2的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得到StRtg2的三維空間模型，結(jié)果顯示，α螺旋與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)是三級(jí)結(jié)構(gòu)中的主要組成部分，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符(圖3)。

圖3 StRtg2 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Three dimensional structure prediction of StRtg2

2.3 玉米大斑病菌StRTG2基因進(jìn)化關(guān)系分析

為進(jìn)一步研究玉米大斑病菌與其他物種間的進(jìn)化關(guān)系，對該基因蛋白序列進(jìn)行BlastP，基于其他真菌物種中的氨基酸序列，利用MEGA 7.0鄰近法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。分析結(jié)果表明，玉米大斑病菌與番茄匍柄霉菌(Stemphyliumlycopersici)的RTG2基因間的進(jìn)化關(guān)系最近，其次是與釀酒酵母間的進(jìn)化關(guān)系較近(圖4)。

圖4 RTG2系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of RTG2

2.4 玉米大斑病菌StRTG2在大腸桿菌BL21(DE3)中的原核表達(dá)

首先構(gòu)建了StRTG2的原核表達(dá)載體，將目的基因連接終載后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液PCR后，可以觀測到清晰的長度為1 600 bp左右的條帶，表明片段連接成功。將終載轉(zhuǎn)入BL21中，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行PCR檢測，也可觀察到1 600 bp左右的片段(圖5-A)，用限制性內(nèi)切酶KPNⅠ/EcoRⅠ對載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測到清晰的目的大小片段的條帶(圖5-B)，說明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

A.pET30A-StRTG2載體轉(zhuǎn)化至BL21菌液PCR驗(yàn)證；B.終載pET30a-StRTG2，KPN Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切驗(yàn)證圖。A. PCR diagram of pET30a-StRTG2 transferred into BL21；B. KPN Ⅰ/EcoR Ⅰ enzymatic verification of pET30A-StRTG2.

對誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)菌液處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)的重組菌在70 ku左右的位置出現(xiàn)條帶(圖6)，而生物信息學(xué)預(yù)測StRtg2蛋白約62 ku左右。說明StRTG2原核表達(dá)成功。

圖6 StRTG2基因的原核表達(dá)Fig.6 Prokaryotic expression of StRTG2

2.5 玉米大斑病菌StRTG2不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式分析

基因表達(dá)模式的分析可對基因功能研究起重要作用，為進(jìn)一步探索StRTG2的功能，利用RNA-Seq數(shù)據(jù)分析了該基因在菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘時(shí)期5個(gè)典型的發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，StRTG2在上述5個(gè)時(shí)期均有不同水平的表達(dá)。與菌絲時(shí)期相比，分生孢子、芽管、附著胞、侵入釘時(shí)期表達(dá)量分別為菌絲時(shí)期的1.02，0.51，1.05，0.73倍，結(jié)果說明，StRTG2在附著胞時(shí)期表達(dá)量最高，在芽管時(shí)期最低(圖7)，即該基因在玉米大斑病菌5個(gè)典型的發(fā)育階段雖有差異，但均有表達(dá)。說明StRTG2基因參與病菌生長發(fā)育的調(diào)控過程。

圖7 StRTG2在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式分析Fig.7 Expression patterns analysis of StRTG2 in different developmental stages

3 討論與結(jié)論

已有研究表明，ScRTG2基因參與酵母的線粒體逆行信號(hào)通路并且該基因表達(dá)水平影響細(xì)胞壽命[19]；在煙曲霉相關(guān)研究中表明，給分生孢子提供含有營養(yǎng)的培養(yǎng)條件后，RTG2同源基因表達(dá)受抑制，表明該基因可能在調(diào)控病菌分生孢子休眠狀態(tài)過程發(fā)揮作用[20]；本研究首次擴(kuò)增玉米大斑病菌中StRTG2基因并對StRtg2蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明，StRtg2蛋白與釀酒酵母ScRtg2蛋白親緣關(guān)系較近，也含有保守的Ppx-Gppa結(jié)構(gòu)域，推測該基因所編碼的蛋白在玉米大斑病菌中也可能具有磷酸水解酶活性。

另有文獻(xiàn)表明，酵母在抵抗由乙酸誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡的過程中RTG2與HOG1間可能有直接調(diào)控作用[8]，本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示，StHOG1對StRTG3具有調(diào)控作用，而RTG復(fù)合體又是線粒體逆行信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子。因此，可以推測HOG通路間可能與RTG線粒體逆行信號(hào)通路間存在交叉調(diào)控[21]。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對StRtg2蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析，誘導(dǎo)表達(dá)了StRtg2蛋白，但StRTG2的基因功能及其與HOG-MAPK途徑間交叉調(diào)控的機(jī)制還有待研究。因此，在后續(xù)的研究中，應(yīng)利用基因沉默及過表達(dá)技術(shù)進(jìn)一步探究StHOG1基因與StRTG2基因間調(diào)控關(guān)系，并在蛋白水平驗(yàn)證兩者是否互作。明確StRTG2的基因功能及其對病菌致病性的影響，為制備殺真菌藥物制劑制備提供理論基礎(chǔ)。

本研究通過擴(kuò)增StRTG2基因序列，發(fā)現(xiàn)其全長為1 695 bp，不含有內(nèi)含子；構(gòu)建StRTG2的原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)，顯示其蛋白大小約70 ku；該基因編碼的蛋白為穩(wěn)定蛋白，含有保守的Ppx-Gppa結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞質(zhì)中的可能性較大；該基因在玉米大斑病菌附著胞時(shí)期表達(dá)水平最高，芽管時(shí)期最低，表明該基因可能對病菌附著胞發(fā)育過程具有一定調(diào)控作用。