于天飛，謝鵬宇，孫婉姝，李 靜，尹海暢，黎 明，于志丹

(1．齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2．黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3．齊齊哈爾大學(xué) 計(jì)算機(jī)與控制工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒(Muscovyduckparvovirus，MDPV)引起的主要發(fā)生在3周內(nèi)的雛番鴨的一種急性傳染病，俗稱番鴨“三周病”[1-3]?；疾》啽憩F(xiàn)以腹瀉、軟腳和喘氣為主要特征，發(fā)病率40%～50%，死亡率在50%～80%，對番鴨飼養(yǎng)業(yè)的危害極大[4-6]。MDPV為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科依賴細(xì)小病毒屬成員，根據(jù)最新版ICTV病毒分類，MDPV 和與其親緣關(guān)系密切的鵝細(xì)小病毒(Gooseparvovirus，GPV)[7]被列為單一種，即雁形目依賴細(xì)小病毒1[8]。MDPV 基因組為約5.1 kb的單鏈DNA，基因組兩端為末端倒置重復(fù)序列(ITR)[9]?；蚪M包含2 個(gè)開放閱讀框(ORF)，左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS，受P9啟動子調(diào)控，通過對mRNA的選擇性剪切可生成NS1以及NS2蛋白[10-11]；右側(cè)ORF 編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP，受P41啟動子調(diào)控，通過對mRNA選擇性剪切以及起始密碼子的選擇性使用可編碼VP1、VP2 和VP3 3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[12-13]。有研究表明，鴨真核翻譯延伸因子1(Eukaryotic translation elongation factor 1A1，eEF1A1)可與鵝細(xì)小病毒VP1蛋白產(chǎn)生相互作用，并參與了GPV的增殖過程[14]。NS蛋白作為調(diào)節(jié)蛋白與MDPV的復(fù)制增殖有關(guān)，推測其可能與宿主eEF1A1產(chǎn)生互作。本研究通過大腸桿菌表達(dá)MDPV YL08株NS1蛋白、北京鴨eEF1A1蛋白和浙東白鵝eEF1A1蛋白，并通過GST pull-down 進(jìn)行了體外驗(yàn)證重組蛋白NS1與水禽eEF1A1的相互作用試驗(yàn)，旨在為MDPV與宿主細(xì)胞蛋白互作及其復(fù)制機(jī)制的研究奠定一定的理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和抗體 質(zhì)粒pET-32a、pGEX-6P-1，E.coli菌種DH5α和Rosetta(DE3)由齊齊哈爾大學(xué)動物免疫學(xué)研究室保存。MDPV YL08株感染番鴨血清、HRP標(biāo)記兔抗鴨IgG由齊齊哈爾大學(xué)動物免疫學(xué)研究室制備保存。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記GST、His標(biāo)簽單克隆抗體購自Thermo Fisher公司。PierceTMGST Protein Interaction Pull-Down Kit購自Thermo Fisher公司。

1.1.2 主要試劑 T4DNA連接酶、BamH Ⅰ和XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。高保真KOFTaq酶、dNTP mix和4氯-1-奈酚(4-CN)購自哈爾濱超峰生物科技發(fā)展有限公司。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)購自北京索萊寶科技有限公司。質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收小提試劑盒購自O(shè)mega 公司。蛋白預(yù)染Marker購自Thermo Fisher公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建 參照GenBank中收錄的北京鴨eEF1A1和浙東白鵝eEF1A1基因序列(GenBank登錄號：XM_027454993、XM_013172141)，根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化，由蘇州金唯智生物股份有限公司合成，合成質(zhì)粒命名為pUC57-DeEF1A1和pUC57-GeEF1A1。合成基因的兩端預(yù)留BamHⅠ和XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。北京鴨、浙東白鵝eEF1A1基因全長1 389 bp，編碼462 個(gè)氨基酸。用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切含有MDPV YL08株[15]NS1基因的重組質(zhì)粒pUC57-NS1、pUC57-DeEF1A1和pUC57-GeEF1A1，回收目的片段NS1、DeEF1A1和GeEF1A1。利用T4DNA連接酶將目的片段分別插入至pGEX-6p-1或pET-32a的BamHⅠ和XhoⅠ多克隆位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化DH5α，涂布固體LB平板(Amp，100 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)14 h。挑取單個(gè)菌落于液體LB(Amp 100 μg/mL)中，37 ℃培養(yǎng)14 h，提取質(zhì)粒。單(BamH Ⅰ)、雙酶切(BamH Ⅰ和XhoⅠ)鑒定質(zhì)粒。相應(yīng)質(zhì)粒由哈爾濱博仕生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。重組質(zhì)粒分別命名為pGEX-DeEF1A1、pET-GeEF1A1、pET-NS1和pGEX-NS1。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 重組質(zhì)粒pGEX-DeEF1A1、pET-GeEF1A1、pET-NS1和pGEX-NS1分別轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)，涂布含有Amp 100 μg/mL的固體LB平板。37 ℃培養(yǎng)12～14 h，挑取單菌落，獲得重組菌株。重組菌首先接種含有Amp 100 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12～14 h。再以1%比例轉(zhuǎn)接新鮮的含有Amp 100 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)0.5～0.6時(shí)，加入IPTG(終濃度至1.0 mmol/L)，37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分時(shí)段收獲菌液沉淀，SDS-PAGE電泳分析重組蛋白表達(dá)情況。重組蛋白分別命名為GST-DeEF1A1、TRX-GeEF1A1、TRX-NS1和GST-NS1。

1.2.3 重組蛋白GST-DeEF1A1和TRX-GeEF1A1的純化及鑒定 SDS-PAGE電泳后，參照文獻(xiàn)[16]采用切膠純化法純化重組蛋白。采用Bradford檢測法分別對重組蛋白的含量進(jìn)行測定[17]。參照文獻(xiàn)[16]的方法采用HRP標(biāo)記的GST或His標(biāo)簽單克隆抗體進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.2.4 重組蛋白TRX-NS1和GST-NS1的純化及鑒定 重組蛋白TRX-NS1和GST-NS1的純化及HRP標(biāo)記的GST或His標(biāo)簽單克隆抗體進(jìn)行鑒定的過程同1.2.3。Western Blot鑒定重組蛋白TRX-NS1和GST-NS1的抗原性。純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)印至NC膜上，采用5%脫脂乳溶液封閉，4 ℃過夜，用PBST溶液重復(fù)洗滌3次，10 min/次，浸入PBS溶液1∶200稀釋的MDPV感染番鴨血清中，4 ℃過夜。棄去一抗稀釋液，用PBST溶液洗滌NC膜3 遍，10 min/次。然后用PBS溶液洗滌NC膜1 遍，10 min/次。把NC膜浸入PBS溶液1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記兔抗鴨IgG中，4 ℃過夜。棄去二抗溶液，用無磷酸鹽緩沖液洗滌NC膜，共3遍，10 min/次。將NC膜移至新鮮配制的4-CN溶液中，放入恒溫箱中，37 ℃避光顯色5 min。經(jīng)觀察，當(dāng)顯色顏色深度合適時(shí)，用去離子水洗滌，終止顯色反應(yīng)。

1.2.5 GST pull-down驗(yàn)證 GST-DeEF1A1與TRX-NS1、GST-NS1與TRX-GeEF1A1的互作。

1.2.5.1 誘餌蛋白的固定 參照PierceTMGST Protein Interaction Pull-Down Kit說明書，按照TBS 緩沖液和裂解液1∶1的體積比混合制備洗液；每對組合(GST-DeEF1A1/TRX-NS1、GST-NS1/TRX-GeEF1A1)設(shè)置1組試驗(yàn)組，5組對照組；吸取試劑盒中的谷胱甘肽瓊脂糖樹脂加入濾柱中，50 μL/濾柱；加入400 μL洗液，蓋上頂帽，上下溫和地顛倒8～10 次，使樹脂充分平衡，打開底塞，把濾柱放入一個(gè)收集管中；室溫下離心 1 min，5 000 r/min，棄掉收集管中的洗液，重新插入濾柱；重復(fù)上述洗滌步驟 4 次；將重組蛋白GST-DeEF1A1、GST-NS1和GST蛋白分別用洗液稀釋至1 mg/mL；將每個(gè)濾柱底部蓋上，頂部打開，將稀釋好的重組蛋白GST-DeEF1A1、GST-NS1和GST蛋白500 μL加入濾柱中；4 ℃，溫和搖動孵育30 min；去掉濾柱底部的塞子，將濾柱置于收集管中；室溫5 000 r/min，離心 1 min；加入 600 μL的洗液，按照前述洗滌步驟重復(fù)洗滌 4 次。

1.2.5.2 重組蛋白TRX-NS1、TRX-GeEF1A1的捕獲 將重組蛋白TRX-NS1、TRX-GeEF1A1和TRX蛋白分別用洗液稀釋至1 mg/mL；向1.2.5.1中已經(jīng)固定有重組蛋白GST-DeEF1A1、GST-NS1或GST蛋白的濾柱中加入稀釋好的重組TRX-NS1蛋白或TRX蛋白樣品 500 μL，4 ℃孵育1 h，每隔 10 min溫和搖動1次；室溫離心1 min，5 000 r/min；加入600 μL的洗液，按照前述洗滌步驟重復(fù)洗滌 4 次。

1.2.5.3 誘餌-捕獲蛋白的洗脫 用洗液配置0.031 g/mL的谷胱甘肽洗脫緩沖液；向1.2.5.2中充分洗滌后的濾柱中加入 250 μL的洗脫液，不斷地溫和搖動，作用 5 min，室溫5 000 r/min，離心1 min，收集管內(nèi)液體置于冰上保存。

1.2.5.4 洗脫液Western Blot分析 將1.2.5.3制備的洗脫液進(jìn)行Western Blot分析。將轉(zhuǎn)印有上述各組洗脫液成分的NC膜放入含5%脫脂乳的封閉液中4 ℃封閉過夜。將封閉液倒掉，用PBST洗滌NC膜，共3遍，10 min/次。然后用PBS洗滌NC膜1 遍，10 min。然后將其放入10 mL同時(shí)含有1∶100 PBS稀釋HRP標(biāo)記的His和GST標(biāo)簽的混合單克隆抗體，4 ℃過夜。棄去混合單抗稀釋液。用PBST洗滌NC膜2 遍，10 min/次。然后用PBS洗滌NC膜1 遍，10 min/次。將NC膜移至新鮮配制的4-CN溶液中，放入37 ℃恒溫箱中，避光顯色，5 min后觀察，去離子水洗滌使反應(yīng)終止。

1.2.6 水禽eEF1A1的氨基酸序列比對及3D結(jié)構(gòu)建模 使用DNAMAN軟件對北京鴨eEF1A1與浙東白鵝eEF1A1氨基酸序列進(jìn)行比對。通過SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive/)進(jìn)行2 種eEF1A1的3D結(jié)構(gòu)同源建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-GeEF1A1、pET-NS1、pGEX-DeEF1A1和pGEX-NS1分別采用BamHⅠ單酶切和BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，酶切結(jié)果與預(yù)期一致。測序結(jié)果表明，目的基因插入載體的位置和閱讀框均正確。

2.2 重組蛋白的表達(dá)

重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)，IPTG誘導(dǎo)后1，2，3，4 h分時(shí)段進(jìn)行取樣，SDS-PAGE結(jié)果表明，獲得了重組蛋白GST-DeEF1A1、TRX-GeEF1A1、TRX-NS1和GST-NS1的表達(dá)，分子量分別為76.9，67.9，89.5，98.6 ku，與預(yù)期相符(圖1，箭頭所示)。

A.SDS-PAGE檢測重組蛋白GST-DeEF1A1的表達(dá)：M.蛋白Marker；1.誘導(dǎo)前的pGEX-6p-1/E.coli Rosetta(DE3)；2.誘導(dǎo)后4 h的pGEX-6p-1/E.coli Rosetta(DE3)；3.未誘導(dǎo)的pGEX-DeEF1A1/E. coli Rosetta(DE3)重組菌；4-7. 誘導(dǎo)1～4 h的pGEX-DeEF1A1/E. coli Rosetta(DE3)重組菌。B. SDS-PAGE檢測重組蛋白TRX-GeEF1A1的表達(dá)：M.蛋白Marker；1.誘導(dǎo)前的pET-32a/E.coli Rosetta(DE3)；2.誘導(dǎo)后4 h的pET-32a/E.coli Rosetta(DE3)；3.未誘導(dǎo)的pET-GeEF1A1/E. coli Rosetta(DE3)重組菌；4-7. 誘導(dǎo)1～4 h的pET-GeEF1A1/E. coli Rosetta(DE3)重組菌。C.SDS-PAGE檢測重組蛋白TRX-NS1的表達(dá)：M.蛋白Marker；1.誘導(dǎo)前的pET-32a/E.coli Rosetta(DE3)；2.誘導(dǎo)后4 h的pET-32a/E.coli Rosetta(DE3)；3.未誘導(dǎo)的pET-NS1/E.coli Rosetta(DE3)重組菌；4-7.誘導(dǎo)1～4 h的pET-NS1/E. coli Rosetta(DE3)重組菌。D.SDS-PAGE檢測重組蛋白GST-NS1的表達(dá)。M.蛋白Marker；1.誘導(dǎo)前的pGEX-6p-1/E.coli Rosetta(DE3)；2. 誘導(dǎo)后4 h的pGEX-6p-1/E.coli Rosetta(DE3)；3. 未誘導(dǎo)的pGEX-NS1/E.coli Rosetta(DE3)重組菌；4-7. 誘導(dǎo)1～4 h的pGEX-NS1/E. coli Rosetta(DE3)重組菌。

2.3 重組蛋白GST-DeEF1A1和TRX-GeEF1A1的鑒定

基于GST、His標(biāo)簽單克隆抗體的Western Blot鑒定的結(jié)果表明，所獲得的表達(dá)蛋白為重組目的蛋白(圖2)。Bradford法測定重組蛋白GST-DeEF1A1的濃度為1.13 mg/mL，獲得重組蛋白TRX-GeEF1A1的濃度為1.31 mg/mL。

2.4 重組蛋白TRX-NS1和GST-NS1的純化及鑒定

重組蛋白TRX-NS1和GST-NS1切膠純化。經(jīng)GST、His標(biāo)簽單克隆抗體鑒定的結(jié)果表明，所獲得的表達(dá)蛋白為重組目的蛋白。重組蛋白TRX-NS1和GST-NS1可與MDPV感染番鴨血清特異性結(jié)合，抗原性良好(圖3)。采用Bradford檢測法對重組蛋白的含量進(jìn)行測定，獲得重組蛋白TRX-NS1和GST-NS1濃度分別為1.33，1.26 mg/mL。

2.5 GST pull-down驗(yàn)證GST-DeEF1A1與TRX-NS1、GST-NS1與TRX-GeEF1A1的互作

GST-DeEF1A1+TRX-NS1試驗(yàn)組洗脫液經(jīng)Western Blot 分析，與抗His和抗GST的混合單克隆抗體作用，分別得到89.5 ku大小的重組蛋白TRX-NS1的條帶和76.9 ku大小的GST-DeEF1A1重組蛋白條帶；對照組GST-DeEF1A1+TRX的洗脫液經(jīng)Western Blot 分析得到大小為76.9 ku的重組蛋白GST-DeEF1A1條帶；對照組GST+TRX-NS1的洗脫液經(jīng)Western Blot 分析得到大小為26.8 ku的標(biāo)簽蛋白GST條帶；對照組GST+TRX的洗脫液經(jīng)Western Blot 分析得到大小為26.8 ku的標(biāo)簽蛋白GST條帶(圖4-A)。上述結(jié)果說明MDPV NS1蛋白可以和北京鴨eEF1A1在體外相互作用。

A.重組蛋白GST-DeEF1A1純化和鑒定結(jié)果：M. 蛋白質(zhì)Marker；1.GST標(biāo)簽蛋白；2.GST-DeEF1A1；3.GST蛋白；4.GST-DeEF1A1；5.TRX蛋白。B.重組蛋白TRX-GeEF1A1純化和鑒定結(jié)果：M.蛋白質(zhì)Marker；1.TRX標(biāo)簽蛋白；2.TRX-GeEF1A1；3.TRX蛋白；4.TRX-GeEF1A1；5.GST蛋白。

M. 蛋白質(zhì)Marker；1.純化的TRX標(biāo)簽蛋白；2. 純化的TRX-NS1蛋白；3. 純化的GST標(biāo)簽蛋白；4. 純化的GST-NS1蛋白；5. His單抗鑒定TRX標(biāo)簽蛋白；6. His單抗鑒定TRX-NS1蛋白；7. GST標(biāo)簽蛋白；8. GST單抗鑒定GST標(biāo)簽蛋白；9. GST單抗鑒定GST-NS1；10. TRX標(biāo)簽蛋白；11. TRX標(biāo)簽蛋白；12. GST標(biāo)簽蛋白；13. MDPV感染血清鑒定TRX-NS1；14. MDPV感染血清鑒定GST-NS1。

GST-NS1+TRX-GeEF1A1試驗(yàn)組洗脫液經(jīng) Western Blot 分析，與抗His和抗GST的混合單克隆抗體作用，僅得到98.6 ku大小的重組蛋白GST-NS1的條帶；對照組GST-NS1+TRX的洗脫液經(jīng)Western Blot 分析得到大小為98.6 ku的重組蛋白GST-NS1條帶；對照組GST+ TRX-GeEF1A1的洗脫液經(jīng)Western Blot 分析得到大小為26.8 ku的標(biāo)簽蛋白GST條帶；對照組GST +TRX的洗脫液經(jīng)Western Blot 分析得到大小為26.8 ku的標(biāo)簽蛋白GST條帶(圖4-B)。上述結(jié)果說明MDPV NS1蛋白不能和浙東白鵝eEF1A1在體外相互作用。

2.6 水禽eEF1A1的氨基酸序列比對及3D結(jié)構(gòu)建模

氨基酸序列比對結(jié)果顯示，北京鴨eEF1A1與浙東白鵝eEF1A1蛋白相似性為98.7%，只是在102-106 aa，108 aa有差異，北京鴨eEF1A1為102MITGT106Q108，浙東白鵝eEF1A1為102LFSFF106K108，其他位置完全一致(圖5)。

3D結(jié)構(gòu)建模結(jié)果如圖6所示。2種蛋白空間結(jié)構(gòu)高度類似，主要包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域富含α螺旋結(jié)構(gòu)，第二結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域富含β折疊結(jié)構(gòu)。二者在一維結(jié)構(gòu)上的差異蛋白102MITGT106Q108形成第二結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)(圓圈處)。

A：M.蛋白Marker；1.GST-DeEF1A1+TRX-NS1；2.GST-DeEF1A1+TRX；3.GST+TRX-NS1；4.GST+TRX；5.TRX-NS1 input；6.柱子空載GST-DeEF1A1。B：M.蛋白Marker；1.GST-NS1+TRX-GeEF1A1；2.GST-NS1+TRX；3.GST+TRX-GeEF1A1；4.GST+TRX；5.TRX-GeEF1A1 input；6.柱子空載GST-NS1。

圖5 水禽eEF1A1氨基酸序列相似性比對Fig.5 Amino acid sequence similarity alignment of waterfowl eEF1A1

圖6 水禽eEF1A1的3D結(jié)構(gòu)建模Fig.6 3D structural modeling of waterfowl eEF1A1

3 結(jié)論與討論

真核翻譯延伸因子包括eEF1A(eukaryotic translation elongation factor 1A)、eEF1B(eukaryotic translation elongation factor 1B)和eEF2(eukaryotic translation elongation factor 2)，三者共同參與蛋白質(zhì)合成過程，發(fā)揮肽鏈延伸作用[18]。eEF1A包含eEF1A1和eEF1A2 2種亞型。eEF1A1和eEF1A2在多肽延伸過程中承擔(dān)相似的功能，但二者表達(dá)模式具有一定的組織差異性[19-20]。eEF1A在細(xì)胞增殖、凋亡以及腫瘤發(fā)生和病毒復(fù)制方面也發(fā)揮著重要作用[21]，其中eEF1A參與RNA病毒復(fù)制的報(bào)道較多，而參與DNA病毒生命周期過程的報(bào)道較少。張雙[14]采用GST pull-down技術(shù)證明鴨eEF1A1與GPV VP1可形成蛋白復(fù)合物，前者可影響GPV在鴨胚成纖維細(xì)胞表面的吸附，并具有抑制GPV增殖作用。而后，又將pcDNA3.0-eEF1A1轉(zhuǎn)染到鴨胚成纖維細(xì)胞中，同時(shí)用GPV感染細(xì)胞，證明在細(xì)胞內(nèi)，eEF1A1表達(dá)量的增加可促進(jìn)GPV增殖。推測eEF1A1可能是在GPV啟動子代病毒復(fù)制過程中起輔助作用。本研究通過GST pull-down 技術(shù)驗(yàn)證重組NS1蛋白與水禽eEF1A1的相互作用，分析結(jié)果表明，MDPV NS1蛋白可以和北京鴨eEF1A1在體外相互作用而不能與浙東白鵝eEF1A1在體外相互作用。北京鴨eEF1A1與浙東白鵝eEF1A1只是在102-106 aa和108 aa有差異，北京鴨eEF1A1為102MITGT106Q108，浙東白鵝eEF1A1為102LFSFF106K108，其他位置完全一致，推測NS1蛋白與北京鴨eEF1A1、浙東白鵝eEF1A1在體外互作的差異性可能與這7個(gè)氨基酸有關(guān)。通過SWISS-MODEL進(jìn)行水禽eEF1A1的同源3D結(jié)構(gòu)建模結(jié)果表明，2種蛋白空間結(jié)構(gòu)高度類似，二者在一維結(jié)構(gòu)上的差異蛋白102MITGT106Q108(102LFSFF106K108)形成第二結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。推測該螺旋結(jié)構(gòu)與第二結(jié)構(gòu)域其他2個(gè)α螺旋所圍成的空腔可能是MDPV NS1蛋白與水禽eEF1A1的互作結(jié)合位點(diǎn)；第二結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)的差異可能是MDPV NS1蛋白可以和北京鴨eEF1A1在體外相互作用而不能與浙東白鵝eEF1A1在體外相互作用的原因。