張花錦，王鴻周，周廣義，張晨靜，韓玉芬

(濮陽市婦幼保健院 生殖醫(yī)學(xué)中心，河南 濮陽 457000)

我國近期調(diào)查結(jié)果顯示，國內(nèi)不孕癥患者占已婚夫婦人數(shù)的10%左右，比1984年調(diào)查的4.8%增加一倍多，發(fā)病率呈上升趨勢。體外受精—胚胎移植技術(shù)已成為一項(xiàng)針對(duì)不孕不育行之有效的人類輔助生殖技術(shù)，其中人類胚胎實(shí)驗(yàn)室則是生殖醫(yī)學(xué)中心的關(guān)鍵，因?yàn)榕咛ヅ囵B(yǎng)是不孕不育治療環(huán)節(jié)中很重要的一環(huán)。高質(zhì)高效的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境對(duì)于胚胎的生長發(fā)育及胚胎實(shí)驗(yàn)室的成功率都起著非常重要的作用[1]。體內(nèi)精卵結(jié)合及發(fā)育是在無菌無塵無味無毒避光的環(huán)境下發(fā)生的，而體外培養(yǎng)過程中配子、胚胎離開了母體穩(wěn)定安全的環(huán)境，沒有了母體的所有保護(hù)屏障，對(duì)體外整個(gè)培養(yǎng)體系發(fā)生的任何微小變化都會(huì)非常敏感，可能會(huì)降低胚胎的發(fā)育潛質(zhì)，甚至發(fā)生遺傳層面的基因突變。對(duì)于濮陽市婦幼保健院新建的胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境溫度和濕度、儀器設(shè)備的性能、試劑耗材的質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)室人員操作熟練程度等，是否能達(dá)到配子(精子和卵子)及胚胎體外操作和生長發(fā)育的要求相當(dāng)關(guān)鍵[2]。

因此，在實(shí)驗(yàn)室啟動(dòng)人類胚胎培養(yǎng)前，為了保證精卵順利結(jié)合及胚胎發(fā)育的培養(yǎng)穩(wěn)定可靠，有必要對(duì)胚胎實(shí)驗(yàn)室整個(gè)培養(yǎng)體系進(jìn)行質(zhì)量控制。小鼠胚胎生物學(xué)檢測已成為評(píng)估新建IVF 實(shí)驗(yàn)室最為常用的方法[3]。本院生殖醫(yī)學(xué)中心于2019年2月底建成IVF 實(shí)驗(yàn)室，為了去除裝修中及新購置的儀器設(shè)備產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物(VOC)，經(jīng)過通風(fēng)處理4 個(gè)月后，先后兩次對(duì)建筑材料以及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行VOC 檢測，結(jié)果均合格。2019年7月至2019年8月，在本中心人體外受精SOP 操作規(guī)范下，購置昆明小白鼠行體外體內(nèi)受精進(jìn)行胚胎實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)行新建實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制，提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和質(zhì)量控制，從而保證本中心人類輔助生殖技術(shù)體外胚胎培養(yǎng)能順利開展。體內(nèi)受精—胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)共10 批次，體外受精—胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)共6 批次，其實(shí)驗(yàn)過程總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小白鼠，雌鼠4～6 周齡，體重約25 g；雄鼠6～8 周齡，體重約30 g，均購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[ 合格證號(hào)SCXK(滬)2017-0005]。在控光(日照約10h，8：00—18：00)、控溫(23±2)℃，自由飲水?dāng)z食恒定環(huán)境下喂養(yǎng)5～7 d，適應(yīng)后再用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑

注射用孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)，購自寧波三生生物科技有限公司。采用瑞典Vitrolife 培養(yǎng)液系列：卵泡收集液G-MOPSPLUS、梯度法精子洗液SpermGrad、洗精受精液G-IVFPLUS、卵裂胚培養(yǎng)液G-1PLUS、囊胚培養(yǎng)液G-2PLUS、OVOIL-100 石蠟油等培養(yǎng)液均在使用前一天下午專用培養(yǎng)皿制作液滴后置于37℃，6% CO2培養(yǎng)箱過夜平衡。G-MOPSPLUS 置于37℃不通氣培養(yǎng)箱過夜平衡。

1.3 耗材與設(shè)備

培養(yǎng)皿、巴斯德管、移液管、2099 離心管等均為美國Falcon 公司產(chǎn)品，均為一次性耗材。CO2氣體純度為99.999%，日本ASTEC 三氣水套式培養(yǎng)箱四臺(tái)(編號(hào)1、2、3、5)，日本ASTEC 抽屜式培養(yǎng)箱(編號(hào)6-1，6-2、6-3、6-4共四個(gè)抽屜)，美國Thermo 二氧化碳培養(yǎng)箱(編號(hào)7、8)。

1.4 小鼠超促排卵

將PMSG 和HCG 干粉均用專用稀釋液配制成100IU/mL 溶液，適量分裝保存于-20℃環(huán)境下。每只雌鼠17：00 腹腔內(nèi)注射PMSG10IU，48 h 后再腹腔內(nèi)注射HCG10IU[4-5]。

1.5 小鼠體內(nèi)受精實(shí)驗(yàn)

分10 批次，每批次選6 只健康雌鼠，HCG 注射后1h 左右將雌雄小鼠以1∶2 比例合籠(為保證交配成功)，次日早上檢查陰道栓，確認(rèn)是否受精，如有陰栓則提示受精。20～22 h 后(次日15：00)雌鼠以頸椎脫臼法處死，實(shí)施酒精消毒背部無菌操作，取出輸卵管，將收集的所有輸卵管放置于G-MOPSPLUS 液滴里，顯微鏡下找到輸卵管膨大部(能隱約看到鼠胚細(xì)胞團(tuán))，用專用鑷子解剖，輕輕刺破，可見小鼠卵子團(tuán)釋放出來，并將其收集到體外操作G-MOPSPLUS 皿中，透明質(zhì)酸酶脫顆粒后將其放置于卵裂胚培養(yǎng)液G-1PLUS 液滴中，每個(gè)液滴最多放10 個(gè)卵，快速觀察受精情況并記錄受精率，然后置于37℃，6% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 小鼠體外受精實(shí)驗(yàn)

分6 批次，鼠精的收集：每批2 只健康雄鼠，取卵日實(shí)施頸椎脫臼法處死，酒精消毒小腹部，無菌操作取出附睪尾，于G-MOPSPLUS 中用專用眼科鑷子從一端順著一個(gè)方向向另一端輕輕擠壓，多次反復(fù)，盡可能多地收集精液，一只使用密度梯度離心法處理精液，另一只使用上游法處理精液[6]。精液優(yōu)化處理與收集方法來自本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)黃國寧老師《輔助生殖實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》新編寫的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。精子優(yōu)化處理后G-IVF 液重懸裝于2099 離心試管中，置于37℃，6% CO2培養(yǎng)箱中獲能30 min 左右即可。

鼠卵收集：每批次選5 或6 只健康雌鼠，HCG 注射14 h 后實(shí)施頸椎脫臼法處死雌鼠，酒精消毒背部無菌操作取出輸卵管，將收集的所有輸卵管放置于G-MOPSPLUS 液滴里，解剖顯微鏡下找到輸卵管膨大部(能隱約看到鼠胚細(xì)胞團(tuán))，用專用鑷子，輕輕刺破，可見小鼠卵子團(tuán)釋放出來，并將其收集到體外操作G-MOPSPLUS 皿中沖洗3 次，并分別將其轉(zhuǎn)移至G-IVF受精液滴中，每1 卵子團(tuán)放1 個(gè)液滴中，放置于37℃，6%CO2培養(yǎng)箱中等待受精。

體外受精：顯微鏡下觀察獲能后的精子活力與濃度，取適量精子懸液加至待受精卵子細(xì)胞團(tuán)的液滴中，使培養(yǎng)滴中精子濃度調(diào)到約5.0×106/mL，置于37℃，6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)受精，4～6 h 后將卵子在G-1PLUS液清洗3 次后置于卵裂培養(yǎng)G-1PLUS 液滴中，觀察受精情況并記錄，于37℃，6% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 原核及卵裂期胚胎的觀察與培養(yǎng)

D0：16：00 點(diǎn)左右觀察第二極體和原核，記錄受精情況，并將其轉(zhuǎn)至已過夜平衡的卵裂培養(yǎng)液G-1PLUS中繼續(xù)培養(yǎng)；D1：上午觀察2 細(xì)胞并記錄；D2：上午觀察4 細(xì)胞期胚胎，下午觀察8 細(xì)胞期胚胎，并將其轉(zhuǎn)至已過夜平衡的囊胚培養(yǎng)液G-2PLUS 中繼續(xù)培養(yǎng)；D3：上午觀察桑椹胚并記錄；D4：上午早期囊胚觀察；D5～D6：上午囊胚觀察并記錄。

參考本中心SOP 統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，如受精率、卵裂率和囊胚形成率，其中受精率=受精數(shù)/獲卵數(shù)；卵裂率=2C胚胎數(shù)/ 受精數(shù)；囊胚形成率= 囊胚數(shù)/8C 胚胎數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本鼠胚實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行10 批次，共收集到1 478 枚卵，其中2PN 細(xì)胞1 378 枚，分別放入不同培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。見表1。

表1 小鼠體內(nèi)受精及不同培養(yǎng)箱胚胎培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)

2.2 體外受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本鼠胚實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行6 批次，共收集到721 枚卵，體外受精后獲2PN 細(xì)胞665 枚，囊胚形成581 枚，囊胚形成率約為87.01%，培養(yǎng)結(jié)果見表2、表3；其中1～6 批次一部分小鼠精液洗滌處理采用上游法，另一半采用密度梯度離心法，密度梯度離心法處理精液后其受精率高于上游法，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，組間卵裂率和囊胚形成率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表4。

表2 小鼠體外受精—上游法精液洗滌處理后胚胎培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)

表3 小鼠體外受精—密度梯度離心法精液洗滌處理后胚胎培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)

表4 小鼠體外受精—不同的精液洗滌處理方法對(duì)胚胎培養(yǎng)影響統(tǒng)計(jì)

2.3 抽屜式與非抽屜式培養(yǎng)箱培養(yǎng)小鼠胚胎發(fā)育結(jié)果比較統(tǒng)計(jì)

經(jīng)分析，日本ASTEC 三氣水套式培養(yǎng)箱(編號(hào)1、2、3、5)和美國Thermo 二氧化碳培養(yǎng)箱(編號(hào)7、8)培養(yǎng)結(jié)局比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，日本ASTEC 抽屜式培養(yǎng)箱(編號(hào)6-1，6-2、6-3、6-4 共四個(gè)抽屜)培養(yǎng)卵裂率為96.06%，與非抽屜式培養(yǎng)箱培養(yǎng)結(jié)局比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.799，P=0.371，P＞0.05)；囊胚形成率91.91%，明顯高于非抽屜式培養(yǎng)箱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義統(tǒng)計(jì)(χ2=6.034，P=0.014，P＜0.05)。見表5。

表5 抽屜式與非抽屜式培養(yǎng)箱培養(yǎng)小鼠胚胎發(fā)育結(jié)果比較統(tǒng)計(jì)

3 討論

胚胎實(shí)驗(yàn)室是輔助生殖技術(shù)整個(gè)鏈條里的核心，這是輔助生殖技術(shù)與其他學(xué)科最大區(qū)別所在，建立穩(wěn)定可靠的胚胎實(shí)驗(yàn)室，將有助于輔助生殖技術(shù)的成功。實(shí)驗(yàn)室在開展人類輔助生殖技術(shù)之前，必須檢測其培養(yǎng)體系是否適合胚胎的培養(yǎng)，而鼠胚實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴行z測對(duì)胚胎有害的毒性環(huán)境，且有較高的敏感性。鼠胚實(shí)驗(yàn)的初始變量可以是配子、合子或者2 細(xì)胞胚胎，最終觀察指標(biāo)是囊胚形成情況[7-8]。因本中心是新建實(shí)驗(yàn)室，采取體內(nèi)體外兩種受精方式收集更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來檢測整個(gè)培養(yǎng)體系及胚胎實(shí)驗(yàn)人員的操作技能。

兩組實(shí)驗(yàn)昆明系小鼠詳細(xì)記錄2- 細(xì)胞胚胎體外培養(yǎng)情況，在新建人體外受精培養(yǎng)室環(huán)境下，體內(nèi)受精實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了7 批次，共獲卵1 478 枚，2PN 1 378 枚；體外受精實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行6 批次，共獲卵721 枚，2PN 665 枚。體內(nèi)體外兩種受精方式受精率卵裂率囊胚形成率均達(dá)到胚胎實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。說明鼠胚實(shí)驗(yàn)體內(nèi)體外兩種受精方式均能用于胚胎培養(yǎng)體系的質(zhì)量控制與管理。體內(nèi)受精組共收集到1 378 枚受精卵，形成2 細(xì)胞1 324枚，囊胚形成1 184 枚，囊胚形成率89.42%，結(jié)果證實(shí)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境合格。同時(shí)將獲得的鼠胚隨機(jī)放入10 臺(tái)培養(yǎng)箱中(實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)啟動(dòng)后用于人類胚胎培養(yǎng))，統(tǒng)計(jì)所有培養(yǎng)箱中囊胚形成情況，結(jié)果顯示，經(jīng)過72 h 培養(yǎng)，所有培養(yǎng)箱能發(fā)育到囊胚期或孵化囊胚階段的2 細(xì)胞胚胎達(dá)到80%以上，符合輔助生殖實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。其中抽屜培養(yǎng)箱囊胚形成率更高，抽屜式培養(yǎng)箱與其他非抽屜式培養(yǎng)箱相比，囊胚形成率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明實(shí)驗(yàn)室所有培養(yǎng)箱都合乎培養(yǎng)要求，并且抽屜式培養(yǎng)箱更適合培養(yǎng)囊胚，從而指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室囊胚培養(yǎng)時(shí)首選抽屜式培養(yǎng)箱。而受精率與卵裂率差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。原因有三：(1)抽屜式培養(yǎng)箱為CO2、O2、N2三氣同時(shí)供應(yīng)，培養(yǎng)環(huán)境更穩(wěn)定，更接近人體內(nèi)胚胎發(fā)育環(huán)境要求。(2)抽屜式培養(yǎng)箱與非抽屜式培養(yǎng)箱相比，優(yōu)化的腔體內(nèi)部空間設(shè)計(jì)，大幅度提高了溫度，CO2、O2、N2三氣的恢復(fù)速度，以保證胚胎培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定。(3)抽屜式培養(yǎng)箱氣體比例更精準(zhǔn)化，更利于囊胚培養(yǎng)。有研究證明[9]，低比例氧氣含量的大氣環(huán)境可以提高囊胚的形成率。本次實(shí)驗(yàn)不僅加強(qiáng)和提高了胚胎實(shí)驗(yàn)室人員操作熟練程度，更規(guī)范和改善了實(shí)驗(yàn)技術(shù)能力，在以后工作中，囊胚培養(yǎng)盡量選擇抽屜式培養(yǎng)箱培養(yǎng)法則。

上游法與密度梯度離心法是目前輔助生殖技術(shù)精液處理最常用的精子優(yōu)化方法。有實(shí)驗(yàn)研究表明[10]研究表明，密度梯度離心法精子回收率及精子質(zhì)量高于上游法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組使用密度梯度離心法和上游法處理精液后所獲得的受精率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，密度梯度離心法獲得的受精結(jié)局明顯優(yōu)于直接上游法。原因分析可能為以下三點(diǎn)：(1)與精子上游法相比，密度梯度離心法能更好地分離精子和非細(xì)胞及碎片，從而回收更多形態(tài)正常的精子，并且明顯增加精子的活力和體外生存能力[11]。(2)密度梯度離心法處理精子時(shí)，活力好及形態(tài)正常的精子回收率高，從而提高精卵結(jié)合的可能性。(3)上游法處理精子，需要精液與培養(yǎng)液共同放在培養(yǎng)箱孵育1h，時(shí)間較長。研究表明[12]上游法處理精子會(huì)增加精子代謝產(chǎn)物活性氧的生成，造成精子氧化損傷，從而影響精卵結(jié)合能力。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，上游法處理精子，每一條活動(dòng)精子不可能都會(huì)發(fā)生上游，活動(dòng)精子回收率不能保證，有時(shí)操作過程中上游液與底部精液分界面分辨不清，回收精子中不動(dòng)精子增多，卵細(xì)胞受精時(shí)活動(dòng)精子濃度較低，不能達(dá)到本實(shí)驗(yàn)室SOP 要求(活動(dòng)精子濃度不小于5.0×106/mL)，從而降低精卵結(jié)合的機(jī)會(huì)。

綜上所述，輔助生殖技術(shù)過程中，精液優(yōu)化推薦采用密度梯度離心法，特別是針對(duì)精液活力及濃度分析質(zhì)量比較差的人群。兩種精液處理方法對(duì)卵裂率和囊胚形成率無顯著影響，原因可能是卵細(xì)胞精卵結(jié)合時(shí)的選擇也是優(yōu)勝劣汰，優(yōu)選的精子更有可能與卵細(xì)胞結(jié)合，兩種方法產(chǎn)生的胚胎發(fā)育環(huán)境是一致的，精液優(yōu)化處理方法對(duì)胚胎發(fā)育影響可能比較小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)也證實(shí)了整個(gè)胚胎培養(yǎng)體系、培養(yǎng)環(huán)境及胚胎師操作技能已經(jīng)達(dá)到質(zhì)控要求。

胚胎實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制一直是胚胎學(xué)家工作的重點(diǎn)。但是，配子收集、受精以及胚胎培養(yǎng)等過程復(fù)雜，影響因素眾多，因此也是難點(diǎn)。鼠胚實(shí)驗(yàn)已成為評(píng)估新建輔助生殖胚胎實(shí)驗(yàn)室最為常用的方法，黃國寧老師的《輔助生殖實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》也曾提到，鼠胚實(shí)驗(yàn)是檢測培養(yǎng)體系是否合格，更是規(guī)范整個(gè)胚胎培養(yǎng)體系，標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)過程，更接近體內(nèi)環(huán)境下胚胎發(fā)育過程。整個(gè)鼠胚實(shí)驗(yàn)，在胚胎實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程嚴(yán)格執(zhí)行前提下，使得實(shí)驗(yàn)人員的操作技術(shù)以及操作熟練度得到了很大的完善和提高。實(shí)驗(yàn)中收集的數(shù)據(jù)均已達(dá)標(biāo)，給我們以后開展工作增強(qiáng)了信心。但必須明確一點(diǎn)，鼠胚培養(yǎng)結(jié)果不能完全反映人類胚胎的安全性，沒有任何一種方法可以配子、胚胎的發(fā)育及存活的檢測試驗(yàn)，但這些實(shí)驗(yàn)可以檢測對(duì)胚胎有害的毒性環(huán)境[1]?？梢?，鼠胚實(shí)驗(yàn)依舊是一個(gè)需要不斷改進(jìn)的胚胎生物檢測系統(tǒng)，也督促實(shí)驗(yàn)室人員在以后工作中完善實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)完整收集與整理，做好實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)質(zhì)控，形成持續(xù)性胚胎實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制模式，發(fā)現(xiàn)問題，分析問題，保證后期結(jié)果的穩(wěn)定性。