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榿葉唐棣果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化及有機(jī)酸和揮發(fā)性成分分析

2021-09-03 10:00:10張卓睿姜貴全
中國(guó)釀造 2021年8期
關(guān)鍵詞:產(chǎn)酸量果醋總酸

于 杰,韓 菁,張卓睿,2,姜貴全

(1.北華大學(xué) 林學(xué)院,吉林 吉林 132013;2.長(zhǎng)白山特色森林資源保育與高效利用國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 吉林 132013)

榿葉唐棣(Amelanchier alnifoliaNutt.)薔薇科(Rosaceae)唐棣屬落葉灌木或小喬木,果實(shí)形似藍(lán)莓[1],每100 g鮮果中含鈣為88 mg,又稱為高鈣果[2]。果實(shí)中富含果膠、花色苷以及多酚類和黃酮類化合物,果膠可以治療腹瀉、對(duì)預(yù)防高血壓和糖尿病等疾病具有良好效果[3-4];花色苷具有降低膽固醇、保護(hù)心臟、預(yù)防心腦血管疾病等作用[5-6];多酚類物質(zhì)抗氧化活性高,效果優(yōu)于維生素E,能夠調(diào)節(jié)血糖血脂、保護(hù)血管[7];黃酮類化合物可通過(guò)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成來(lái)抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。

果醋是以水果或果品加工下腳料為主要原料,經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵釀制而成的一種兼具水果和食醋風(fēng)味的新型飲品[9],同時(shí)也是集保健食療為一體,營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酸味調(diào)味品[10]。果醋中的風(fēng)味物質(zhì)醇類、酯類、醛類、酸類、酮類等物質(zhì)[11-12],有機(jī)酸作為果醋風(fēng)味物質(zhì)的主要成分,對(duì)果醋整體感官有重要的影響[13]。

本研究以榿葉唐棣為原料,采用半固態(tài)發(fā)酵法釀制榿葉唐棣果醋,以總酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),研究并優(yōu)化了榿葉唐棣果醋發(fā)酵工藝,并對(duì)其中有機(jī)酸及揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,以期為榿葉唐棣果醋的開發(fā)和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榿葉唐棣:2019年6月采摘于北華大學(xué)磨盤山實(shí)習(xí)基地,-80 ℃冷凍保藏。

果酒專用酵母:湖北安琪酵母股份有限公司;醋酸菌:煙臺(tái)帝伯仕自釀?dòng)邢薰尽?/p>

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(草酸、蘋果酸、酒石酸、丙二酸、乳酸、乙酸)(純度均>98%):上海精純?cè)噭┯邢薰荆涣姿岫滗@、磷酸、氫氧化鈉等(均為分析純),甲醇(色譜純):天津致遠(yuǎn)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋:國(guó)華電器有限公司;BSA224S電子天平:北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;SPX-2500S-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱:上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;LC-15C高效液相色譜儀(high performance liquid chromatograph,HPLC)(配備紫外檢測(cè)器和Essentia LCsolution 15C工作站):日本島津公司;Agilent 5977C-7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS):美國(guó)安捷倫儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榿葉唐棣果醋發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

榿葉唐棣果→自然解凍→挑選除雜→清洗→破碎→成分調(diào)整→酵母菌活化→接種酵母菌→酒精發(fā)酵→過(guò)濾→果酒、果渣復(fù)配→加麩皮、稻殼、醋酸菌→醋酸發(fā)酵→過(guò)濾→成品

操作要點(diǎn):

挑選及預(yù)處理:選擇成熟度好、表面光滑、顏色紫紅、無(wú)病蟲害、無(wú)腐爛、無(wú)機(jī)械性損傷的榿葉唐棣果實(shí),于室溫(25 ℃)條件下自然解凍后用蒸餾水清洗至表面清潔;

破碎:著潔凈的食品級(jí)一次性手套,進(jìn)行手工破碎,避免打漿破碎過(guò)度;

成分調(diào)整:按酒精發(fā)酵最適宜的初始糖度含量(22%),在破碎好的榿葉唐棣果漿中加入綿白糖,攪拌均勻后備用。

果酒酵母活化:將蔗糖溶解于蒸餾水中,配制成為100 g/L的糖液,加入果酒酵母(糖液與果酒酵母質(zhì)量比為10∶1),輕微攪拌,在29 ℃水浴鍋中活化20 min,當(dāng)溶液冒出很多細(xì)小氣泡時(shí),酵母活化完成。

酒精發(fā)酵:按酒精發(fā)酵最適宜的酵母菌添加量(2%),向榿葉唐棣果漿中加入活化好的果酒酵母,攪拌均勻,倒入容器,裝罐量占容器容量的2/3,容器口用保鮮膜密封,放入培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵,30 ℃發(fā)酵9 d。

過(guò)濾:果酒經(jīng)過(guò)500目紗布自然沉降過(guò)濾。

醋酸發(fā)酵:發(fā)酵所需的容器都要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌,防止在發(fā)酵過(guò)程中受到其他雜菌污染,滅菌后加入適量麩皮、稻殼,果酒與酒渣體積占容器容量的1/2,用兩層紗布覆蓋,放入培養(yǎng)箱中在一定溫度條件下靜置有氧發(fā)酵,在發(fā)酵過(guò)程中注意時(shí)常攪拌,防止果醋發(fā)干變臭。

過(guò)濾:果醋經(jīng)過(guò)500目紗布過(guò)濾,得到果醋成品。

1.3.2 榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以總酸含量為評(píng)定指標(biāo),分別考察初始酒精度(5%vol、7%vol、9%vol、11%vol、13%vol),果酒果渣質(zhì)量比(1∶1、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2),發(fā)酵溫度(24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃),醋酸菌添加量(1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%)對(duì)醋酸發(fā)酵的影響。

1.3.3 榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),以初始酒精度(A)、發(fā)酵溫度(B)、醋酸菌添加量(C)、果酒果渣質(zhì)量比(D)為評(píng)價(jià)因素,以總酸含量為考察指標(biāo),優(yōu)化榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵條件,正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

1.3.4 測(cè)定方法

酒精度的測(cè)定:參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計(jì)法[14];總酸的測(cè)定:參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的pH電位法[15]。

有機(jī)酸含量的測(cè)定:①樣品預(yù)處理:原果汁和優(yōu)化發(fā)酵條件后的榿葉唐棣果醋,過(guò)200目紗布,取5.00 mL待測(cè)樣品,加入2.00 g聚酰胺后于70 ℃水浴鍋中加熱5 min,于3 000 r/min條件下離心10 min,取上清液加入2.00 mL 1 mol/L磷酸溶液和5.00 mL蒸餾水,過(guò)0.45 μm濾膜,備用。②色譜條件:參考GB 5009.157—2016《食品有機(jī)酸的測(cè)定》中果汁飲料及果汁、果味碳酸飲料的方法[16]。

有機(jī)酸定性定量方法:將樣品的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間作對(duì)照進(jìn)行定性,采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)樣品含量進(jìn)行定量。

揮發(fā)性成分的測(cè)定采用GC-MS法。①樣品預(yù)處理:參考彭幫柱等[17]的方法。②氣相色譜(GC)條件:色譜柱為HP-5ms(30 m×0.32 mm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣氦氣(He)(純度>99.999%);流速1.0 mL/min;不分流進(jìn)樣。程序升溫,起始溫度為40 ℃于10 min后,以3 ℃/min升溫至85 ℃,保持2 min,然后以5 ℃/min升溫至110 ℃,保持2 min;最后以8 ℃/min升溫至230 ℃,保持8 min。質(zhì)譜(MS)條件:電子電離(electron ionization,EI)源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;質(zhì)量掃描范圍為35~400 m/z。

揮發(fā)性成分定性定量方法:將GC-MS檢測(cè)的未知化合物的圖譜與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(national insititute of standards and technology,NIST)譜庫(kù)II并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)(retention index,RI)進(jìn)行比對(duì)定性。采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)樣品含量進(jìn)行定量。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、計(jì)算,采用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 榿葉唐棣果醋發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

由圖1可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),榿葉唐棣果醋產(chǎn)酸量也隨之增加,在發(fā)酵初期醋酸菌處于生長(zhǎng)繁殖階段,導(dǎo)致產(chǎn)酸量較低,當(dāng)發(fā)酵到12 d時(shí)產(chǎn)酸量開始大量增加,產(chǎn)酸明顯,當(dāng)發(fā)酵到18 d時(shí),產(chǎn)酸量達(dá)到峰值,為3.66 g/100 mL,當(dāng)發(fā)酵到21 d時(shí),產(chǎn)酸量開始下降,由于前期酸的積累使醋酸菌生長(zhǎng)受到抑制,產(chǎn)酸量下降。因此,確定18 d為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)榿葉唐棣果醋總酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on total acid content of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.2 初始酒精度的確定

由圖2可知,在醋酸發(fā)酵初期產(chǎn)酸量都較低,因?yàn)榇姿峋幱谏L(zhǎng)繁殖階段,產(chǎn)酸效果未表現(xiàn)出來(lái);初始酒精度較低時(shí),產(chǎn)酸量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中較少,是因?yàn)榇姿峋衫玫木凭窟^(guò)低導(dǎo)致產(chǎn)酸量過(guò)少;初始酒精度過(guò)高時(shí),產(chǎn)酸量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中幾乎無(wú)變化,是由于酒精度過(guò)高使醋酸菌不耐受,醋酸菌在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中受到抑制[18],初始酒精度為9%vol時(shí),產(chǎn)酸量在第18天出現(xiàn)峰值,為3.8 g/100 mL。因此,確定初始酒精度為9%vol。

圖2 初始酒精度對(duì)榿葉唐棣果醋總酸的影響Fig.2 Effect of initial alcohol contents on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.3 果酒果渣質(zhì)量比的確定

由圖3可知,在發(fā)酵初期產(chǎn)酸都較少,當(dāng)果酒與果渣復(fù)配比例相對(duì)較低為1∶1時(shí),由于容器中氧氣含量相對(duì)較高,醋酸菌大量生長(zhǎng)繁殖代謝旺盛,發(fā)酵過(guò)程結(jié)束過(guò)早[19];果酒與果渣復(fù)配比例為1∶2時(shí),產(chǎn)酸量在第15天出現(xiàn)峰值,而后下降,由于容器中氧氣流通不足,醋酸菌生命活動(dòng)受到抑制,在發(fā)酵后期產(chǎn)酸量降低;果酒與果渣復(fù)配比例為1∶1.6時(shí),產(chǎn)酸量在第18天出現(xiàn)峰值,為3.12 g/100 mL。因此,確定果酒與果渣復(fù)配比例為1∶1.6。

圖3 果酒果渣質(zhì)量比對(duì)榿葉唐棣果醋總酸的影響Fig.3 Effect of mass ratio of fruit wine and pomace on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.4 醋酸菌添加量的確定

由圖4可知,隨著醋酸菌添加量的增加,產(chǎn)酸量隨之增加;在發(fā)酵初期,過(guò)少的添加量產(chǎn)酸量相對(duì)較少;過(guò)高的添加量會(huì)使醋酸菌發(fā)生自溶現(xiàn)象,產(chǎn)生大量的代謝廢物,影響醋酸菌的生長(zhǎng)繁殖,在醋酸發(fā)酵后期產(chǎn)酸量降低[20],醋酸菌添加量為2.0%時(shí),在發(fā)酵末期的產(chǎn)酸量相對(duì)較多,第18天產(chǎn)酸量達(dá)到峰值,為3.65 g/100 mL。因此,確定醋酸菌添加量為2.0%。

圖4 醋酸菌添加量對(duì)榿葉唐棣果醋總酸含量的影響Fig.4 Effect of acetic acid bacteria addition on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.5 發(fā)酵溫度的確定

由圖5可知,在發(fā)酵初期,隨著溫度的升高,產(chǎn)酸量隨之增加;過(guò)低的溫度會(huì)影響醋酸菌的生長(zhǎng),不易存活,導(dǎo)致發(fā)酵不完全,產(chǎn)酸量相對(duì)較少;過(guò)高的溫度會(huì)使酸大量揮發(fā),醋酸菌老化死亡,在醋酸發(fā)酵后期產(chǎn)酸量降低[20],發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí),總酸含量在第18天達(dá)到峰值,為3.71 g/100 mL。因此,確定發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)榿葉唐棣果醋總酸含量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.6 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

由表2可知,正交試驗(yàn)中的最佳工藝組合為A2B2C2D3,即初始酒精度9%vol,發(fā)酵溫度30 ℃,醋酸菌添加量2.0%,果酒與果渣質(zhì)量比1.0∶1.6,在此條件下榿葉唐棣果醋總酸含量為4.75 g/100 mL,結(jié)合單因素試驗(yàn),總酸含量峰值均出現(xiàn)在第18天,因此將第18天確定為醋酸發(fā)酵終止時(shí)間。

表2 榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table2 Results and analysis of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

由表3可知,在發(fā)酵過(guò)程中,初始酒精度(A)和發(fā)酵溫度(B)對(duì)榿葉唐棣果醋的總酸含量影響極顯著(P<0.01),醋酸菌添加量(C)對(duì)榿葉唐棣果醋的總酸含量影響顯著(P<0.05),果酒與果渣質(zhì)量比(D)影響不顯著(P>0.05)。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal tests results

2.2 有機(jī)酸組成分析

采用反相高效液相色譜法對(duì)榿葉唐棣原果汁和果醋中的有機(jī)酸進(jìn)行定性和定量分析,結(jié)果見表4。

表4 榿葉唐棣果汁和果醋有機(jī)酸含量分析結(jié)果Table4 Analysis results of organic acid content in Amelanchier alnifolia juice and fruit vinegar

由表4可知,榿葉唐棣果汁中蘋果酸含量最高為1.20 mg/mL,丙二酸次之,為0.47 mg/mL,草酸和乙酸含量相對(duì)較低,這些有機(jī)酸構(gòu)成了榿葉唐棣漿果獨(dú)特的口感;榿葉唐棣果醋中,乙酸含量最高為5.00 g/100 mL,其次是丙二酸和乳酸,分別為0.43 mg/mL、0.25 mg/mL。與榿葉唐棣果汁相比,榿葉唐棣果醋中蘋果酸含量明顯降低,這是由于酒精發(fā)酵過(guò)程中部分蘋果酸被轉(zhuǎn)化成酒精和乳酸,因此蘋果酸含量下降,隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行,榿葉唐棣果醋中蘋果酸、丙二酸含量持續(xù)下降,在醋酸發(fā)酵過(guò)程中醋酸菌利用乙醇發(fā)酵產(chǎn)生大量乙酸,造成乙酸含量突增,同時(shí)有一部分糖發(fā)酵不完全轉(zhuǎn)化成了乳酸,使得乳酸含量相對(duì)增加[21]。

2.3 揮發(fā)性成分組成分析

榿葉唐棣果汁和果醋揮發(fā)性成分分析結(jié)果見表5。

由表5可知,榿葉唐棣果汁中分離出6種化合物,分別為乙酸-3-甲基丁酯、乙酸乙酯、苯甲醛、丁酸、苯甲醇、2-甲氧基-4-乙烯苯酚,其中苯甲醛(73.53%)含量相對(duì)較高,是榿葉唐棣果汁中揮發(fā)性成分的主要組分,具有苦杏仁味。從榿葉唐棣果醋中分離出5種化合物,分別為3-羥基-2-丁酮、乙酸、乙酸乙酯、苯甲酸、苯甲醇,其中乙酸(35.62%)含量最高,是榿葉唐棣果醋中揮發(fā)性成分的主要組分,具有刺激性的酸味,乙酸乙酯(24.32%)含量次之,具有酯香和果香。隨著酒精發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行,酵母菌利用糖進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵產(chǎn)生大量乙醇,使得進(jìn)行醋酸發(fā)酵之前就已經(jīng)具有香氣較為復(fù)雜;當(dāng)進(jìn)行到醋酸發(fā)酵階段,醋酸菌利用乙醇有氧發(fā)酵產(chǎn)生大量乙酸,發(fā)酵液具有明顯的醋酸味,同時(shí)乙酸與乙醇酯化生成乙酸乙酯,構(gòu)成了果醋的獨(dú)特香味[22-25]。

表5 榿葉唐棣果汁和果醋揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table5 Analysis results of volatile components in Amelanchier alnifolia juice and fruit vinegar

3 結(jié)論

榿葉唐棣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值相對(duì)較高,可以用來(lái)發(fā)酵果酒和果醋,通過(guò)試驗(yàn)分析,確定了榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵最佳條件為初始酒精度9%vol,果酒與果渣質(zhì)量比1.0∶1.6,醋酸菌添加量2.0%,發(fā)酵溫度30 ℃,醋酸發(fā)酵時(shí)間18 d。其中,初始酒精度和發(fā)酵溫度為影響醋酸發(fā)酵的極顯著性因素,酵母添加量為顯著性因素。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵,總酸含量為4.75 g/100 mL。

榿葉唐棣果醋的6種有機(jī)酸中乙酸(5.00 mg/mL)含量最高,乳酸(0.25 mg/mL)和丙二酸(0.43 mg/mL)次之。5種揮發(fā)性成分分別是3-羥基-2-丁酮、乙酸、乙酸乙酯、苯甲酸、苯甲醇,其中含量較高的是乙酸(35.62%)和乙酸乙酯(24.32%)。在發(fā)酵過(guò)程中,榿葉唐棣果汁香氣較為酸澀,有榿葉唐棣獨(dú)特的果酸味,而榿葉唐棣果醋成分復(fù)雜多樣,集酯香、果香以及醋的酸味于一體,香氣宜人且濃郁。

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