于 杰，韓 菁，張卓睿，2，姜貴全

（1.北華大學(xué) 林學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.長(zhǎng)白山特色森林資源保育與高效利用國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013）

榿葉唐棣（Amelanchier alnifoliaNutt.）薔薇科（Rosaceae）唐棣屬落葉灌木或小喬木，果實(shí)形似藍(lán)莓[1]，每100 g鮮果中含鈣為88 mg，又稱為高鈣果[2]。果實(shí)中富含果膠、花色苷以及多酚類和黃酮類化合物，果膠可以治療腹瀉、對(duì)預(yù)防高血壓和糖尿病等疾病具有良好效果[3-4]；花色苷具有降低膽固醇、保護(hù)心臟、預(yù)防心腦血管疾病等作用[5-6]；多酚類物質(zhì)抗氧化活性高，效果優(yōu)于維生素E，能夠調(diào)節(jié)血糖血脂、保護(hù)血管[7]；黃酮類化合物可通過(guò)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成來(lái)抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。

果醋是以水果或果品加工下腳料為主要原料，經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵釀制而成的一種兼具水果和食醋風(fēng)味的新型飲品[9]，同時(shí)也是集保健食療為一體，營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酸味調(diào)味品[10]。果醋中的風(fēng)味物質(zhì)醇類、酯類、醛類、酸類、酮類等物質(zhì)[11-12]，有機(jī)酸作為果醋風(fēng)味物質(zhì)的主要成分，對(duì)果醋整體感官有重要的影響[13]。

本研究以榿葉唐棣為原料，采用半固態(tài)發(fā)酵法釀制榿葉唐棣果醋，以總酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究并優(yōu)化了榿葉唐棣果醋發(fā)酵工藝，并對(duì)其中有機(jī)酸及揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，以期為榿葉唐棣果醋的開發(fā)和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榿葉唐棣：2019年6月采摘于北華大學(xué)磨盤山實(shí)習(xí)基地，-80 ℃冷凍保藏。

果酒專用酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：煙臺(tái)帝伯仕自釀?dòng)邢薰尽?/p>

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品（草酸、蘋果酸、酒石酸、丙二酸、乳酸、乙酸）（純度均＞98%）：上海精純?cè)噭┯邢薰荆涣姿岫滗@、磷酸、氫氧化鈉等（均為分析純），甲醇（色譜純）：天津致遠(yuǎn)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；BSA224S電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SPX-2500S-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LC-15C高效液相色譜儀（high performance liquid chromatograph，HPLC）（配備紫外檢測(cè)器和Essentia LCsolution 15C工作站）：日本島津公司；Agilent 5977C-7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）：美國(guó)安捷倫儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榿葉唐棣果醋發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

榿葉唐棣果→自然解凍→挑選除雜→清洗→破碎→成分調(diào)整→酵母菌活化→接種酵母菌→酒精發(fā)酵→過(guò)濾→果酒、果渣復(fù)配→加麩皮、稻殼、醋酸菌→醋酸發(fā)酵→過(guò)濾→成品

操作要點(diǎn)：

挑選及預(yù)處理：選擇成熟度好、表面光滑、顏色紫紅、無(wú)病蟲害、無(wú)腐爛、無(wú)機(jī)械性損傷的榿葉唐棣果實(shí)，于室溫（25 ℃）條件下自然解凍后用蒸餾水清洗至表面清潔；

破碎：著潔凈的食品級(jí)一次性手套，進(jìn)行手工破碎，避免打漿破碎過(guò)度；

成分調(diào)整：按酒精發(fā)酵最適宜的初始糖度含量（22%），在破碎好的榿葉唐棣果漿中加入綿白糖，攪拌均勻后備用。

果酒酵母活化：將蔗糖溶解于蒸餾水中，配制成為100 g/L的糖液，加入果酒酵母（糖液與果酒酵母質(zhì)量比為10∶1），輕微攪拌，在29 ℃水浴鍋中活化20 min，當(dāng)溶液冒出很多細(xì)小氣泡時(shí)，酵母活化完成。

酒精發(fā)酵：按酒精發(fā)酵最適宜的酵母菌添加量（2%），向榿葉唐棣果漿中加入活化好的果酒酵母，攪拌均勻，倒入容器，裝罐量占容器容量的2/3，容器口用保鮮膜密封，放入培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵，30 ℃發(fā)酵9 d。

過(guò)濾：果酒經(jīng)過(guò)500目紗布自然沉降過(guò)濾。

醋酸發(fā)酵：發(fā)酵所需的容器都要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌，防止在發(fā)酵過(guò)程中受到其他雜菌污染，滅菌后加入適量麩皮、稻殼，果酒與酒渣體積占容器容量的1/2，用兩層紗布覆蓋，放入培養(yǎng)箱中在一定溫度條件下靜置有氧發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中注意時(shí)常攪拌，防止果醋發(fā)干變臭。

過(guò)濾：果醋經(jīng)過(guò)500目紗布過(guò)濾，得到果醋成品。

1.3.2 榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以總酸含量為評(píng)定指標(biāo)，分別考察初始酒精度（5%vol、7%vol、9%vol、11%vol、13%vol），果酒果渣質(zhì)量比（1∶1、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2），發(fā)酵溫度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃），醋酸菌添加量（1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%）對(duì)醋酸發(fā)酵的影響。

1.3.3 榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以初始酒精度（A）、發(fā)酵溫度（B）、醋酸菌添加量（C）、果酒果渣質(zhì)量比（D）為評(píng)價(jià)因素，以總酸含量為考察指標(biāo)，優(yōu)化榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵條件，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

1.3.4 測(cè)定方法

酒精度的測(cè)定：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計(jì)法[14]；總酸的測(cè)定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的pH電位法[15]。

有機(jī)酸含量的測(cè)定：①樣品預(yù)處理：原果汁和優(yōu)化發(fā)酵條件后的榿葉唐棣果醋，過(guò)200目紗布，取5.00 mL待測(cè)樣品，加入2.00 g聚酰胺后于70 ℃水浴鍋中加熱5 min，于3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液加入2.00 mL 1 mol/L磷酸溶液和5.00 mL蒸餾水，過(guò)0.45 μm濾膜，備用。②色譜條件：參考GB 5009.157—2016《食品有機(jī)酸的測(cè)定》中果汁飲料及果汁、果味碳酸飲料的方法[16]。

有機(jī)酸定性定量方法：將樣品的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間作對(duì)照進(jìn)行定性，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)樣品含量進(jìn)行定量。

揮發(fā)性成分的測(cè)定采用GC-MS法。①樣品預(yù)處理：參考彭幫柱等[17]的方法。②氣相色譜（GC）條件：色譜柱為HP-5ms（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣氦氣（He）（純度＞99.999%）；流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。程序升溫，起始溫度為40 ℃于10 min后，以3 ℃/min升溫至85 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升溫至110 ℃，保持2 min；最后以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持8 min。質(zhì)譜（MS）條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍為35～400 m/z。

揮發(fā)性成分定性定量方法：將GC-MS檢測(cè)的未知化合物的圖譜與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national insititute of standards and technology，NIST）譜庫(kù)II并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)（retention index，RI）進(jìn)行比對(duì)定性。采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)樣品含量進(jìn)行定量。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、計(jì)算，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 榿葉唐棣果醋發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，榿葉唐棣果醋產(chǎn)酸量也隨之增加，在發(fā)酵初期醋酸菌處于生長(zhǎng)繁殖階段，導(dǎo)致產(chǎn)酸量較低，當(dāng)發(fā)酵到12 d時(shí)產(chǎn)酸量開始大量增加，產(chǎn)酸明顯，當(dāng)發(fā)酵到18 d時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到峰值，為3.66 g/100 mL，當(dāng)發(fā)酵到21 d時(shí)，產(chǎn)酸量開始下降，由于前期酸的積累使醋酸菌生長(zhǎng)受到抑制，產(chǎn)酸量下降。因此，確定18 d為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)榿葉唐棣果醋總酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on total acid content of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.2 初始酒精度的確定

由圖2可知，在醋酸發(fā)酵初期產(chǎn)酸量都較低，因?yàn)榇姿峋幱谏L(zhǎng)繁殖階段，產(chǎn)酸效果未表現(xiàn)出來(lái)；初始酒精度較低時(shí)，產(chǎn)酸量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中較少，是因?yàn)榇姿峋衫玫木凭窟^(guò)低導(dǎo)致產(chǎn)酸量過(guò)少；初始酒精度過(guò)高時(shí)，產(chǎn)酸量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中幾乎無(wú)變化，是由于酒精度過(guò)高使醋酸菌不耐受，醋酸菌在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中受到抑制[18]，初始酒精度為9%vol時(shí)，產(chǎn)酸量在第18天出現(xiàn)峰值，為3.8 g/100 mL。因此，確定初始酒精度為9%vol。

圖2 初始酒精度對(duì)榿葉唐棣果醋總酸的影響Fig.2 Effect of initial alcohol contents on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.3 果酒果渣質(zhì)量比的確定

由圖3可知，在發(fā)酵初期產(chǎn)酸都較少，當(dāng)果酒與果渣復(fù)配比例相對(duì)較低為1∶1時(shí)，由于容器中氧氣含量相對(duì)較高，醋酸菌大量生長(zhǎng)繁殖代謝旺盛，發(fā)酵過(guò)程結(jié)束過(guò)早[19]；果酒與果渣復(fù)配比例為1∶2時(shí)，產(chǎn)酸量在第15天出現(xiàn)峰值，而后下降，由于容器中氧氣流通不足，醋酸菌生命活動(dòng)受到抑制，在發(fā)酵后期產(chǎn)酸量降低；果酒與果渣復(fù)配比例為1∶1.6時(shí)，產(chǎn)酸量在第18天出現(xiàn)峰值，為3.12 g/100 mL。因此，確定果酒與果渣復(fù)配比例為1∶1.6。

圖3 果酒果渣質(zhì)量比對(duì)榿葉唐棣果醋總酸的影響Fig.3 Effect of mass ratio of fruit wine and pomace on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.4 醋酸菌添加量的確定

由圖4可知，隨著醋酸菌添加量的增加，產(chǎn)酸量隨之增加；在發(fā)酵初期，過(guò)少的添加量產(chǎn)酸量相對(duì)較少；過(guò)高的添加量會(huì)使醋酸菌發(fā)生自溶現(xiàn)象，產(chǎn)生大量的代謝廢物，影響醋酸菌的生長(zhǎng)繁殖，在醋酸發(fā)酵后期產(chǎn)酸量降低[20]，醋酸菌添加量為2.0%時(shí)，在發(fā)酵末期的產(chǎn)酸量相對(duì)較多，第18天產(chǎn)酸量達(dá)到峰值，為3.65 g/100 mL。因此，確定醋酸菌添加量為2.0%。

圖4 醋酸菌添加量對(duì)榿葉唐棣果醋總酸含量的影響Fig.4 Effect of acetic acid bacteria addition on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.5 發(fā)酵溫度的確定

由圖5可知，在發(fā)酵初期，隨著溫度的升高，產(chǎn)酸量隨之增加；過(guò)低的溫度會(huì)影響醋酸菌的生長(zhǎng)，不易存活，導(dǎo)致發(fā)酵不完全，產(chǎn)酸量相對(duì)較少；過(guò)高的溫度會(huì)使酸大量揮發(fā)，醋酸菌老化死亡，在醋酸發(fā)酵后期產(chǎn)酸量降低[20]，發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，總酸含量在第18天達(dá)到峰值，為3.71 g/100 mL。因此，確定發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)榿葉唐棣果醋總酸含量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.6 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

由表2可知，正交試驗(yàn)中的最佳工藝組合為A2B2C2D3，即初始酒精度9%vol，發(fā)酵溫度30 ℃，醋酸菌添加量2.0%，果酒與果渣質(zhì)量比1.0∶1.6，在此條件下榿葉唐棣果醋總酸含量為4.75 g/100 mL，結(jié)合單因素試驗(yàn)，總酸含量峰值均出現(xiàn)在第18天，因此將第18天確定為醋酸發(fā)酵終止時(shí)間。

表2 榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table2 Results and analysis of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

由表3可知，在發(fā)酵過(guò)程中，初始酒精度（A）和發(fā)酵溫度（B）對(duì)榿葉唐棣果醋的總酸含量影響極顯著（P＜0.01），醋酸菌添加量（C）對(duì)榿葉唐棣果醋的總酸含量影響顯著（P＜0.05），果酒與果渣質(zhì)量比（D）影響不顯著（P＞0.05）。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal tests results

2.2 有機(jī)酸組成分析

采用反相高效液相色譜法對(duì)榿葉唐棣原果汁和果醋中的有機(jī)酸進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果見表4。

表4 榿葉唐棣果汁和果醋有機(jī)酸含量分析結(jié)果Table4 Analysis results of organic acid content in Amelanchier alnifolia juice and fruit vinegar

由表4可知，榿葉唐棣果汁中蘋果酸含量最高為1.20 mg/mL，丙二酸次之，為0.47 mg/mL，草酸和乙酸含量相對(duì)較低，這些有機(jī)酸構(gòu)成了榿葉唐棣漿果獨(dú)特的口感；榿葉唐棣果醋中，乙酸含量最高為5.00 g/100 mL，其次是丙二酸和乳酸，分別為0.43 mg/mL、0.25 mg/mL。與榿葉唐棣果汁相比，榿葉唐棣果醋中蘋果酸含量明顯降低，這是由于酒精發(fā)酵過(guò)程中部分蘋果酸被轉(zhuǎn)化成酒精和乳酸，因此蘋果酸含量下降，隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，榿葉唐棣果醋中蘋果酸、丙二酸含量持續(xù)下降，在醋酸發(fā)酵過(guò)程中醋酸菌利用乙醇發(fā)酵產(chǎn)生大量乙酸，造成乙酸含量突增，同時(shí)有一部分糖發(fā)酵不完全轉(zhuǎn)化成了乳酸，使得乳酸含量相對(duì)增加[21]。

2.3 揮發(fā)性成分組成分析

榿葉唐棣果汁和果醋揮發(fā)性成分分析結(jié)果見表5。

由表5可知，榿葉唐棣果汁中分離出6種化合物，分別為乙酸-3-甲基丁酯、乙酸乙酯、苯甲醛、丁酸、苯甲醇、2-甲氧基-4-乙烯苯酚，其中苯甲醛（73.53%）含量相對(duì)較高，是榿葉唐棣果汁中揮發(fā)性成分的主要組分，具有苦杏仁味。從榿葉唐棣果醋中分離出5種化合物，分別為3-羥基-2-丁酮、乙酸、乙酸乙酯、苯甲酸、苯甲醇，其中乙酸（35.62%）含量最高，是榿葉唐棣果醋中揮發(fā)性成分的主要組分，具有刺激性的酸味，乙酸乙酯（24.32%）含量次之，具有酯香和果香。隨著酒精發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，酵母菌利用糖進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵產(chǎn)生大量乙醇，使得進(jìn)行醋酸發(fā)酵之前就已經(jīng)具有香氣較為復(fù)雜；當(dāng)進(jìn)行到醋酸發(fā)酵階段，醋酸菌利用乙醇有氧發(fā)酵產(chǎn)生大量乙酸，發(fā)酵液具有明顯的醋酸味，同時(shí)乙酸與乙醇酯化生成乙酸乙酯，構(gòu)成了果醋的獨(dú)特香味[22-25]。

表5 榿葉唐棣果汁和果醋揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table5 Analysis results of volatile components in Amelanchier alnifolia juice and fruit vinegar

3 結(jié)論

榿葉唐棣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值相對(duì)較高，可以用來(lái)發(fā)酵果酒和果醋，通過(guò)試驗(yàn)分析，確定了榿葉唐棣果醋醋酸發(fā)酵最佳條件為初始酒精度9%vol，果酒與果渣質(zhì)量比1.0∶1.6，醋酸菌添加量2.0%，發(fā)酵溫度30 ℃，醋酸發(fā)酵時(shí)間18 d。其中，初始酒精度和發(fā)酵溫度為影響醋酸發(fā)酵的極顯著性因素，酵母添加量為顯著性因素。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵，總酸含量為4.75 g/100 mL。

榿葉唐棣果醋的6種有機(jī)酸中乙酸（5.00 mg/mL）含量最高，乳酸（0.25 mg/mL）和丙二酸（0.43 mg/mL）次之。5種揮發(fā)性成分分別是3-羥基-2-丁酮、乙酸、乙酸乙酯、苯甲酸、苯甲醇，其中含量較高的是乙酸（35.62%）和乙酸乙酯（24.32%）。在發(fā)酵過(guò)程中，榿葉唐棣果汁香氣較為酸澀，有榿葉唐棣獨(dú)特的果酸味，而榿葉唐棣果醋成分復(fù)雜多樣，集酯香、果香以及醋的酸味于一體，香氣宜人且濃郁。