周明青,彭琪瑤,左珊如,李學廣,周軍華,賀權源

（湖南師范大學醫(yī)學院,中國湖南 長沙 410013）

人類基因組中有1 700～1 900個編碼轉錄因子（transcription factor,TF）的基因[1]。其中,ZBTB（zinc finger and BTB domain）轉錄因子家族包含49個成員[2],其基本結構特征為N末端的BTB結構域和C末端的C2H2/Krüppel型鋅指（zine finger,ZF）蛋白結構域[3]。

BTB也稱為POZ（痘病毒和鋅指）結構域,存在于多種痘病毒相關蛋白質中[4]。BTB/POZ結構域是一個進化上保守的介導蛋白質-蛋白質相互作用的結構域[5],其功能廣泛而復雜,包括轉錄抑制[6]、細胞骨架調節(jié)[7～8]、蛋白質泛素化[9]以及調控基于Cul3的E3連接酶復合物的二聚化等[2]。

C2H2/Krüppel型鋅指蛋白結構域最早在非洲爪蟾轉錄因子ⅢA中被發(fā)現[10],因含有鋅指并能結合DNA而得名。其包含兩個半胱氨酸和兩個組氨酸（C2H2）殘基,它們與Zn2+結合起來形成一種“手指”形的多肽空間構型。該多肽折疊結構能與DNA結合,是最常見的DNA結合結構域之一[11]。

BTB-ZF蛋白也稱為POK（POZ和Krüppel型鋅指）蛋白[12]。這個大家族的許多成員是重要的轉錄因子和基因組調控因子,其中一些與發(fā)育和癌癥有關,最具有代表性的是B細胞淋巴瘤6（B cell lymphoma 6,BCL6）[13～15]、PLZF（promyelocytic leukaemia zinc finger）[16～18]、癌癥高甲基化因子 1（hypermethylated in cancer 1,HIC-1）[19～21]和端粒相關蛋白TZAP（telomeric zinc finger-associated proxBTB domain containing 40,又名ZNF923）是該家族中相對分子質量最大的一個成員,它在進化中高度保守[3～5],但其生理功能尚不清楚。目前,僅有報道稱ZBTB40的高表達可以促進成骨細胞生成并增加骨密度,降低女性骨質疏松風險[24],而基于ZBTB40可變剪切得到的lncRNA ZBTB40-IT1則通過調節(jié) WNT4、RUNX2、OSX、ALP、COL1A1、OPG和RANKL的表達抑制成骨并促進破骨細胞的生成,和ZBTB40發(fā)揮著相反的作用,但是lncRNA ZBTB40-IT1的這種作用可被ZBTB40抑制[25]。另外,有研究證明ZBTB40在石斑魚的各階段生殖細胞中高表達[26]。本研究旨在初步研究ZBTB40在人類細胞系、肝癌組織和小鼠組織中的表達規(guī)律,初步探討其正常生理功能及其與人類疾病之間的關系,同時構建穩(wěn)定表達細胞株,為未來深入研究ZBTB40的生理及病理功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

10～12 周齡的 SPF（specific pathogen free）級野生型實驗小鼠C57BL/6J共兩只,購買自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.1.2 臨床樣本

本研究所用臨床組織樣本均來源于中南大學湘雅醫(yī)學院,包含肝癌/癌旁組織標本5對,均經過患者本人同意和醫(yī)院負責人同意。標本簡要信息見表1。

表1 病例標本簡要信息Table 1 Brief information about case samples

1.1.3 質粒和感受態(tài)細胞

質粒載體pDONR-ZBTB40（Gene ID:9923;F8WAI8）和慢病毒包裝載體（pLenti-EF1a-Flag-HA-attR-IRES-puro）獲贈于中山大學生命科學院。部分大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購買自長沙鼎國生物技術有限責任公司,部分DH5α由本實驗制備。

1.1.4 測序引物

質粒載體pDONR-ZBTB40的測序引物為通用引物 M13F（5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′）和 M13R（5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′）,慢病毒載體質粒（pLenti-EF1a-Flag-HA-attR-IRES-puro）和慢病毒表達質粒（pLenti-Flag-ZBTB40-HA-attB-IRES-puro）的測序引物為 EF1A-F（5′-TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC-3′）和 IRES-R（5′-CCTCACATTGCCAAAAGACG-3′）。

1.1.5 其他主要試劑和材料

LB肉湯瓊脂和LB肉湯培養(yǎng)基源自生工生物工程（上海）股份有限公司;瓊脂糖（regular agarose）源自BIOWEST公司（德國）;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）源自Thermo-Fisher Scientific公司（美國）;basal medium/F-12K培養(yǎng)基購自GENVIEW公司（美國）;RPMI medium modified（1640）培養(yǎng)基購自HyCloneTM公司（美國）;TRIzol、Tris-HCl和吐溫（瀘試）購自國藥集團化學試劑有限公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（#K1622）、GatewayTMLR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix和Lipofectamine 2000轉染試劑均購買自ThermoFisher Scientific公司（美國）;Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;QuickBlockTMWestern Antibody Dilution Solution購自碧云天生物技術有限公司;1 kb DNA ladder（500～10 000 bp）購買自廣州東盛生物科技有限公司;miRNA Kit（R6842-01）和Endo-free Plasmid Mini KitⅠ購買自OMEGA Bio-Tek公司（美國）。限制性內切酶 ApaⅠ、AgeⅠ（BshTⅠ）、NotⅠ購買自 ThermoFisher Scientific 公司（美國）。文中所用抗體的相關信息如表2所示。人骨肉瘤細胞（U2OS）、人成骨肉瘤細胞（Saos-2）、人宮頸癌細胞（HeLa）、人胚胎腎細胞（HEK 293T）獲贈于中山大學生命科學院,人非小細胞肺癌細胞（A549）、人乳腺癌細胞（MCF-7）獲贈于湖南師范大學鄧錫云教授課題組,人前列腺癌細胞（PC-3）購買自湖南吉凱基因科技有限公司,人肝癌組織細胞（HepG2）獲贈于湖南師范大學藥學系。

表2 本研究所使用的抗體列表Table 2 List of antibodies used in the study

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及蛋白質提取

用60 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞,其中U2OS、Saos-2、HeLa、HepG2 和 HEK 293T 細胞的培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM;MCF-7細胞在培養(yǎng)時需額外添加0.01 mg/mL人胰島素;PC-3細胞的培養(yǎng)基為含10%FBS的F-12K;A549細胞使用含10%FBS的1640培養(yǎng)基。待細胞生長密度為90%～100%時,棄培養(yǎng)基,用冰的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）洗去殘留培養(yǎng)基,加入5×SDS loading buffer（250 mmol/L Tris-HCl,pH 6.8;10%SDS;0.5%BPB;50%甘油;5%巰基乙醇）,充分反應后轉移至1.5 mL離心管,蛋白質煮沸變性后將樣品存放于-80℃冰箱備用。

1.2.2 小鼠組織蛋白質的提取

眼科剪、眼科鑷、研缽、研缽棒等器皿用DEPC水浸泡過夜,然后高溫高壓滅菌。隨機選取10～12周齡的健康C57BL/6J雄鼠,用“斷頸法”將其處死;取小鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、膀胱、胸骨和睪丸組織,用生理鹽水清洗后取綠豆大小組織放入無酶處理的研缽,加入液氮碾磨直至組織完全碎裂為粉末;取50～100 mg粉末至1.5 mL離心管并稱重,加入1 mL組織裂解液（50 μL配方:40 μL RIPA裂解液+5 μL蛋白酶抑制劑+5 μL磷酸酶抑制劑+0.5 μL PMSF）,于四維混合儀上4℃裂解1～2 h后最高轉速離心15 min;取上清液加入100 μL 5× SDS loading buffer,變性處理后將樣品存放于-80℃冰箱備用。

1.2.3 蛋白質免疫印跡（Western-blot）

配制8%的分離膠和5%的濃縮膠。上樣后以恒壓80 V電泳30 min,恒壓120 V電泳60 min。濕轉法恒流200 mA轉膜[27];用5%的脫脂奶粉于室溫封閉1～2 h;1×Tris-HCl+吐溫緩沖鹽溶液（Tris-HCl buffer salt & Tween,TBST:20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0;150 mmol/L NaCl;0.1%Tween）洗膜后室溫孵育一抗（1︰500～1︰2000）2 h或4℃孵育過夜;1×TBST洗膜后室溫孵育二抗（1︰3 000）1 h;避光滴加ECL化學發(fā)光液顯影。用ImageJ軟件分析條帶灰度值,采用GraphPad Prism繪圖,利用t檢驗進行差異顯著性分析。

1.2.4 免疫組化

病理石蠟切片由中南大學提供。對切片進行脫蠟處理:56℃烘烤切片2～3 h;浸入二甲苯中3次,每次5 min;逐漸用水環(huán)境替代切片樣本中的二甲苯。采用檸檬酸緩沖液高溫高壓法修復抗原。把切片置于0.1%～0.3%TritonX-100中,室溫浸泡25 min,PBS沖洗3次,每次5 min,增加細胞膜對抗體的滲透性。用3%的H2O2處理切片20 min,PBS沖洗3次,每次5 min,滅活內源性酶。用2%～10%的羊血清處理切片20 min,一抗孵育切片4℃過夜,隨后用PBS沖洗3次,每次5 min。在室溫下,二抗孵育切片30～60 min,繼而用PBS漂洗切片3次,每次5 min。用新配的DAB工作液處理切片5 min以后顯色,蘇木精復染細胞核。最后,切片在經過梯度乙醇脫水和二甲苯透明處理（5 min）后,用中性樹脂封片。

1.2.5 RNA的提取

采用TRIzol法提取細胞和組織的總RNA[28]:收取2.5×106個細胞或50～100 mg組織,加入1 mL TRIzol,充分混勻后加入0.2 mL氯仿/1 mL TRI-zol,振蕩15 s后靜置2～3 min;4℃條件下最高轉速離心15 min,取上清;加入0.5 mL異丙醇,輕輕混勻后室溫靜置10 min;4℃高速離心10 min,棄上清;加入1 mL 75%乙醇,洗滌沉淀;4℃、7 500g離心5 min,棄上清;晾干后加入50 μL DEPC水至沉淀完全溶解,立即測量RNA濃度并記錄A260nm/A280nm的比值。

1.2.6 cDNA的合成

按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書配制逆轉錄體系（20 μL）:總RNA 500 ng,oligo（dT）18primer 1 μL,無酶水加至 12 μL;5× reaction buffer 4 μL,RiboLock RNase inhibitor 1 μL,10 mmol/L dNTP mix 2 μL,RevertAid MMulV RT 1 μL。充分混勻后瞬時離心,將樣本置于PCR儀中,42℃孵育60 min,隨后70℃處理5 min終止反應。將獲得的反應產物（cDNA）置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7qRT-PCR

按照Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix試劑盒說明書配制熒光定量實時聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）體系（20 μL）:Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix 10 μL,正向引物（10 μmol/L）0.4 μL,反向引物（10 μmmol/L）0.4 μL,cDNA 2 μL,ROXⅡ 0.4 μL,ddH2O加至20 μL。每個樣本3個復孔,目的基因和內參的擴增引物見表3。PCR反應程序:95℃預變性3 min;95℃5 s,60℃30 s,循環(huán)40～45次。

表3 qRT-PCR引物序列Table 3 Primers used for qRT-PCR analysis

1.2.8 克隆和測序

根據Gateway Clone反應原理[29]及GatewayTMLR ClonaseTMⅡEnzyme Mix試劑盒說明書配制LR反應體系（10 μL）:entry clone（pDONR-ZBTB40）50～150 ng,destination vector（pLenti-EF1a-Flag-HA-attR-IRES-puro）150 ng,加 TE buffer到 8 μL,加 2 μL LR ClonaseTMⅡ enzyme mix。取 1.5 μL產物轉化大腸桿菌DH5α,隨后將其接種于含有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過夜;挑選合適的單克隆接種到含有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)過夜;提取質粒,將經酶切鑒定正確的樣本送至北京擎科生物科技有限公司進行Sanger測序。

1.2.9 pLenti-Flag-ZBTB40-HA-attB-IRES-puro慢病毒顆粒的制備

待HEK 293T細胞生長至密度為70%～80%時,利用Lipofectamine 2000轉染慢病毒包裝三質粒系統(tǒng)（pLenti-ZBTB40-attB-puro、pMD2.G和ps-PAX2）混合液,48 h后收集細胞上清液并用0.45 μm濾網過濾,濾液為包含病毒顆粒的培養(yǎng)基。

1.2.10 穩(wěn)定表達細胞株的構建

慢病毒顆粒培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS）以1︰1的比例加入目的細胞。48 h后加嘌呤霉素（1～10 μg/mL）,藥篩7 d。藥篩結束后將細胞低密度接種至60 mm培養(yǎng)皿,正常培養(yǎng)至細胞形成單克隆。挑取單克隆至96孔板,進行傳代培養(yǎng)擴增。采用Western-blot方法對各克隆進行驗證,保種凍存合格單克隆細胞株。

1.2.11 數據處理及生物信息分析

使用GraphPad Prism 8.0.2軟件對各組實驗數據進行分析,采用t檢驗進行組間比較。使用https://kmplot.com/analysis/網絡平臺的數據和工具進行總生存率分析（分析時間為2020年12月）。采用Kaplan-Meier模型進行生存分析,采用Logrank檢驗比較組間差異。人肝癌患者生存時間的數據來自TCGA數據庫（共364例,其中男性246例,女性118例）?；虮磉_水平的閾值為所有可能的閾值中,使組間統(tǒng)計學差異最大的值。

2 結果

2.1 ZBTB40在小鼠不同組織中的表達

采用Western-blot檢測ZBTB40在小鼠不同組織中的表達水平,結果如圖1A～B所示:ZBTB40在小鼠肝臟、胸骨和睪丸中表達較高,說明其在小鼠組織中的表達具有較高的組織特異性。本研究首次發(fā)現ZBTB40在小鼠肝臟中的表達甚至高于胸骨和睪丸,提示該蛋白質很可能與正常肝臟的生理功能有一定聯系。另外,Western-blot檢測結果顯示,ZBTB40在小鼠睪丸組織和肝臟組織中的相對分子質量比在小鼠胸骨組織中的相對分子質量更大,提示其可能存在不同的轉錄本。在U-niProt數據庫中,小鼠的ZBTB40基因有兩個轉錄本:Q6PCS8（138.19 kD）和 Q571D3（135.64 kD）。比對兩個轉錄版本的序列發(fā)現,兩種轉錄本共享大部分外顯子,序列基本一致,僅在N端有一些差異（46AA）;本研究所用兩種ZBTB40抗體均可對其進行識別,因此可用同一種抗體進行鑒定（圖1E）。根據相對分子質量,我們推測肝臟、睪丸和胸骨組織中的蛋白質轉錄本分別為Q6PCS8和Q571D3。進一步采用qRT-PCR檢測ZBTB40在小鼠各組織中的mRNA表達水平,結果顯示,其mRNA表達水平在肝臟、睪丸和胸骨中較高（圖1C）,與蛋白質表達趨勢基本一致。有趣的是,在脾臟和肺中,ZBTB40的轉錄本含量較高,但其蛋白質幾乎檢測不到。此外,小鼠肝臟的免疫組化實驗證明,ZBTB40在肝臟實質細胞的細胞核和細胞質中均有表達（圖1D）,且主要集中于細胞核。

圖1 ZBTB40在C57BL/6J小鼠不同組織中的表達（A）采用Western-blot實驗檢測ZBTB40在小鼠9種組織中的表達水平,箭頭指示目標條帶;（B）用ImageJ計算的圖A中蛋白質的定量結果;（C）采用qRT-PCR技術檢測ZBTB40在小鼠組織中的mRNA水平;（D）野生型成年小鼠肝臟HE染色和免疫組織化學染色結果。圖D中,1b、2b小圖中的1為中央靜脈,2為肝細胞索,1b、2b分別為1a和2a中黑色虛線框的放大視野（40×）,2b中黑色箭頭指示ZBTB40在肝細胞核內有表達;（E）小鼠ZBTB40基因兩種剪切本的外顯子差異比較。兩種ZBTB40抗體（abs134922-1、A301-932A）均來源于兔,UniProt ID:Q9NUA8,反應種屬為human和mouse,抗體識別區(qū)域分別用橘色和綠色矩形指示。Fig.1 Expression of ZBTB40 in different tissues of C57BL/6J mice（A）The levels of ZBTB40 protein in 9 tissues of mice compared by Western-blot assay.The arrows indicate target bands;（B）The gray values of the target protein bands in（A）using ImageJ;（C）The mRNA expression levels of ZBTB40 in mouse tissues detected by qRT-PCR;（D）HE staining and immunohistochemical analysis of wild-type adult mouse liver.In Fig.1b,2b,“1”indicates central vein;“2”indicates hepatocyte cord.Figs.1b and 2b show the enlarged fields（40×）enclosed by black dotted-lines in Figs.1a and 2a,respectively.The black arrows point to the nucleus stained by ZBTB40 antibody;（E）Comparison of two isoforms of mouse ZBTB40 gene.Both ZBTB40 antibodies（abs134922-1,A301-932A）were derived from rabbits.UniProt ID:Q9NUA8.Reacted species:human,mouse.The antibody recognition areas are indicated by the orange and green rectangles.

2.2 ZBTB40在多種人類細胞系中的表達

Western-blot檢測結果顯示:ZBTB40在8種人類細胞系中的表達豐度由高到低依次為HeLa、A549、U2OS、PC-3、HEK 293T、HepG2、MCF-7 和Saos-2;在乳腺癌細胞（MCF-7）、成骨肉瘤細胞（Saos-2）中該蛋白質幾乎檢測不到,而在宮頸癌細胞（HeLa）、非小細胞肺癌細胞（A549）和肝癌細胞系（HepG2）中其表達量較高（圖2A～B）。進一步采用qRT-PCR檢測ZBTB40基因在以上細胞中的mRNA表達水平,結果表明其mRNA表達水平和蛋白質表達譜之間有一定差異,比如:Saos-2細胞中ZBTB40的mRNA水平與HeLa細胞相當,而蛋白質水平則遠比HeLa細胞低;A549細胞中ZBTB40的mRNA水平較低且與MCF-7細胞相當,而蛋白質表達水平卻遠高于后者（圖2C）。以上結果提示,這些細胞系中可能存在不同機制對ZBTB40的mRNA翻譯效率和/或蛋白質穩(wěn)定性進行調節(jié),從而導致其mRNA和蛋白質豐度之間存在顯著差異。

圖2 ZBTB40在不同細胞系中的表達（A）采用Western-blot實驗檢測8種人類細胞系中ZBTB40蛋白的相對豐度;（B）采用ImageJ計算的圖A中蛋白質的定量結果;（C）采用qRT-PCR方法檢測ZBTB40的mRNA在8種細胞系中的表達水平。Fig.2 Expression of ZBTB40 in different cell lines（A）The relative abundance of ZBTB40 protein in eight human cell lines analyzed by Western-blot;（B）Quantification for the Western-blot results in（A）using ImageJ;（C）The mRNA levels of ZBTB40 in eight human cell lines using qRT-PCR.

2.3 ZBTB40在人肝癌/癌旁組織中的表達

由于ZBTB40在小鼠肝組織和人類肝癌細胞系（HepG2）中高表達,我們推測其可能在肝臟中發(fā)揮重要作用。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的一種,在我國占肝癌總數的85%左右[30～31]。肝細胞癌旁（hepatocellular para-carcinoma,HCCP）組織通常是指距病灶2～5 cm的組織。為了初步驗證上述推測,我們對5位HCC患者的癌組織/癌旁組織進行了ZBTB40表達水平的檢測。Western-blot結果提示,ZBTB40在腫瘤組織中的表達水平均明顯低于癌旁組織;在有癌癥分級信息的3例樣本中,低分級樣本（HCC-1）相比較高分級的樣本（HCC-2和HCC-5）具有更高的ZBTB40表達水平（圖3A）。樣本HCC-1/HCCP-1和HCC-2/HCCP-2的qRT-PCR結果（圖3B）提示,ZBTB40的mRNA表達趨勢與Westernblot結果一致。我們進一步對HCC-1和HCC-2兩個樣本做了HE和免疫組織化學染色,結果表明,ZBTB40的表達主要聚集于肝癌實質細胞的細胞核,在基質中表達較低（圖3C）。然而,HCC-2為低分化肝癌樣本,存在大量的癌基質,這可能是ZBTB40的總體相對豐度在癌組織低于癌旁組織的主要原因。

圖3 ZBTB40在肝細胞癌/癌旁組織中的表達分析（A）5對癌組織/癌旁組織的蛋白質樣本的Western-blot實驗結果;（B）qRT-PCR檢測樣本HCC-1/HCCP-1、HCC-2/HCCP-2中ZBTB40的mRNA水平,***:P<0.01;（C）HCC-1和HCC-2的HE染色和免疫組織化學染色結果,黑色箭頭指示組織中的肝癌細胞。Fig.3 Expression analysis of ZBTB40 in HCC/HCCP tissues（A）Western-blot results of 5 pairs of HCC/HCCP tissues;（B）The mRNA expression levels of ZBTB40 in HCC-1/HCCP-1 and HCC-2/HCCP-2 samples were detected by qRT-PCR.***:P<0.01;（C）The results of HE and IHC stainings of HCC-1 and HCC-2.The black arrows indicate the HCC cells in the tissues.

2.4 ZBTB40異常表達與肝癌患者預后生存率相關

使用Kaplan-Meier plotter網絡服務,查詢TCGA數據庫中收集的364例人肝癌患者（男性246例,女性118例）的數據,依據ZBTB40蛋白的表達水平,把患者分為ZBTB40高表達組和低表達組,研究兩組患者的預后差異。結果表明,ZBTB40高表達是肝癌患者預后的消極因素[風險比（hazard ratio,HR）=2.25,log（rank P）<0.000 1],增加了患者死亡風險,提示ZBTB40可能是潛在的肝癌預后不良分子標志（圖4A）。已知肝癌在男性中的發(fā)生率遠高于女性[32～33],其原因較為復雜,可能與行為及生理等因素存在差異相關。我們對男性和女性患者分別進行了同樣的預后差異分析,結果表明ZBTB40高表達帶來風險的比例在男性中遠高于女性（2.62 vs.1.8）（圖4B～C）,提示ZBTB40參與了性別相關的肝癌發(fā)生過程。

圖4 ZBTB40的表達水平與肝癌患者預后生存時間的關聯分析（A）ZBTB40表達水平較高和較低的肝癌患者預后生存時間的統(tǒng)計分析;（B～C）具有不同ZBTB40表達水平的男性和女性肝癌患者的生存率分析。Fig.4 The influence of ZBTB40 expression level on overall survival of liver cancer patients（A）Analysis of prognosis and overall survival of patients with liver cancer;（B～C）Survival analysis of male and female HCC patients with different ZBTB40 expression levels.

2.5 ZBTB40慢病毒表達質粒的構建

用Gateway Clone技術構建表達質粒pLenti-Flag-ZBTB40-HA-attB-IRES-puro,擴增后進行快速內切酶AgeⅠ和ApaⅠ雙酶切以及NotⅠ單酶切,采用凝膠電泳驗證片段大小。凝膠電泳結果（圖5B）提示,質粒酶切片段大小正確。選取經酶切鑒定正確的樣本送至北京擎科生物科技有限公司測序,測序結果表明質粒序列無堿基缺失、插入、突變。

圖5 載體質粒和表達質粒的酶切結果（A）SnapGene軟件設計的質粒酶切模擬圖;（B）質粒經AgeⅠ和ApaⅠ雙酶切或NotⅠ單酶切后的凝膠電泳結果。圖中E1、E2為兩個構建的表達質粒單克隆樣本,V1、V2為兩個載體質粒單克隆樣本,MW:分子量標準。Fig.5 Results of enzyme digestion of vector and expression plasmids（A）Plasmid enzyme digestion map simulated by SnapGene software;（B）The results of plasmid enzyme digestion using ApaⅠ & AgeⅠand NotⅠ.E1 and E2 represent clones of the two constructed expression plasmids.V1 and V2 are the plasmid samples.MW:Marker.

2.6 ZBTB40-FLAG穩(wěn)定表達細胞株的構建

經慢病毒包裝、感染U2OS細胞、嘌呤霉素藥篩一周后挑取細胞單克隆并擴增,隨后提取細胞蛋白質進行Western-blot驗證,結果顯示U2OS克隆細胞株（Clone組）中ZBTB40蛋白的表達水平與陰性對照（negative control,NC）相比明顯增高（圖6A～B）。進一步用qRT-PCR檢測實驗細胞株和對照細胞中ZBTB40的mRNA水平,結果顯示實驗細胞株中ZBTB40的mRNA水平同樣顯著增高（圖6C）。以上結果證實,本研究獲得了人ZBTB40的穩(wěn)定表達細胞株。

圖6 ZBTB40穩(wěn)定表達細胞株的鑒定（A～B）Western-blot檢測ZBTB40蛋白的表達水平。其中,圖A的一抗為Human ZBTB40 Rabbit Polyclonal,圖B的一抗為Monoclonal ANTI-FLAG?M2;（C）qRT-PCR法檢測ZBTB40的mRNA表達水平,***:P<0.01。NC代表未做處理的細胞,作為陰性對照;Clone為克隆細胞株。Fig.6 Identification of cell lines stably expressing ZBTB40（A～B）Western-blot was used to detect the expression level of ZBTB40 protein.In Fig.A,Human ZBTB40 Rabbit Polyclonal as primary antibody.In Fig.B,Monoclonal ANTI-FLAG?M2 as primary antibody;（C）The expression trends of ZBTB40 in cells detected by qRT-PCR.***:P<0.01.NC indicates untreated cells,which is used as a negative control;Clone indicates the stable cell clone.

3 討論

近年,越來越多研究表明ZBTB蛋白家族參與了一系列復雜的細胞生理過程如DNA甲基化[19～21]、端粒保護[22～23]等,與多種疾病包括癌癥相關[13～18]。然而,人們對ZBTB蛋白家族的生物功能和相關分子機制還知之甚少。ZBTB40是該家族中相對分子質量最大的成員,其在人類等高等動物中的生理功能也還不清楚。已有研究表明,ZBTB40在雄性石斑魚的各階段生殖細胞中特異性高表達,尤其是在精原細胞和精子細胞中[26]。本研究在小鼠的睪丸組織中也檢測到了ZBTB40的特異性表達（圖1C）,提示該基因是否與小鼠睪丸發(fā)育和精子發(fā)生相關值得深入研究。

本研究首次發(fā)現ZBTB40在小鼠肝臟中高表達（圖1A～C）,提示其可能與肝臟的生理功能有重要關系。而且,其在HepG2細胞系和5例人原發(fā)性肝細胞癌的癌旁組織中均有表達（圖2～3）,提示ZBTB40很可能也在人的正常肝組織中有表達。有意思的是,本研究發(fā)現ZBTB40基因在肝癌細胞中顯著高表達,且該現象在早期和中晚期肝癌中都有發(fā)現（圖3C）,提示ZBTB40的異常表達可能起始于肝癌發(fā)展早期,并持續(xù)至癌癥的中晚期。已知肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程在不同性別中差異明顯[32],本文的生存分析結果顯示ZBTB40的表達水平與男性患者的預后更為相關（圖4）,其原因有待進一步研究?？紤]到已有ZBTB家族成員（如HIC-1）被鑒定為重要的抑癌基因[19～21],估計進一步研究ZBTB40與肝癌發(fā)生發(fā)展之間的關系具有重要意義。

文獻報道,ZBTB40高表達可以促進成骨細胞發(fā)育,增加骨密度,降低女性骨質疏松易感性[24～25]。本研究也檢測到ZBTB40在小鼠的胸骨中高表達（圖1A～C）,但該蛋白質的相對分子質量略小于肝臟和睪丸中ZBTB40的相對分子質量。通過查找數據,我們發(fā)現在人類中也有與之相對應的兩個轉錄本 XP_011540801.1（148 kD）和XP_024307065.1（135 kD）,故推測這個較小的ZBTB40轉錄本也許在人類骨組織中表達。而這兩個轉錄本之間的功能的區(qū)別和聯系是什么？它們選擇性表達的分子機制是什么？值得進一步深入探究。

此外,通過比較ZBTB40在不同細胞和組織中的mRNA和蛋白質水平,我們發(fā)現兩個表達譜之間有相關性,同時也有比較明顯的區(qū)別。這提示在不同細胞和組織中ZBTB40的mRNA和蛋白質存在著不同的調控機制。值得注意的是,有報道顯示,ZBTB40基因編碼的lncRNA具有與其蛋白質產物相反的功能[25],因此在該lncRNA高表達的細胞中,ZBTB40蛋白的豐度很低是完全有可能的。設計針對lncRNA的特異性引物,檢測其在小鼠脾臟和肺組織中的表達水平,將有助于解釋為何在這兩種組織中ZBTB40的mRNA表達水平高而蛋白質卻檢測不到。

4 結論

ZBTB40蛋白在小鼠肝臟、胸骨和睪丸中高水平表達。在人類肝癌組織中,ZBTB40在癌細胞的細胞核中高度聚集,并與患者的生存時間顯著相關。這些結果提示ZBTB40的異常表達可能與肝臟腫瘤的發(fā)展相關,值得進一步研究。此外,本研究成功構建了ZBTB40過表達質粒,為后續(xù)深入研究ZBTB40的生理功能和分子調控機制提供了重要材料。