湯陳宸,吳 昌,李 健,陳 乾,陶 敏,張 純,覃欽博,羅凱坤,劉少軍*

（1.湖南師范大學省部共建淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室,中國湖南 長沙 410081;2.湖南師范大學生命科學學院多倍體魚繁殖與育種技術(shù)教育部工程研究中心,中國湖南 長沙 410081）

遠緣雜交能將不同物種基因組整合到雜交子代中[1]。因此,雜交子代中往往包含了兩個及以上的亞基因組,而亞基因組間的相互作用是雜交優(yōu)勢的基礎(chǔ)。在植物中,遠緣雜交是一種常用的育種方法,如雜交水稻[2]、雜交小麥[3]和雜交菊花[4]等。越來越多的研究表明,很多大自然中現(xiàn)存的植物都來源于物種間的雜交,如花生[5]、棉花[6]等。在高等脊椎動物中,雖然有過一些雜交的報道,但雜交獲得兩性可育后代的報道甚少。在低等脊椎動物的魚類中,目前人們已通過基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)并認為,一些自然界的魚類如紅鯽[7]、鯉[8]等為雜交起源的異源多倍體;但是,通過人工的方式進行亞科間、屬間、種間遠緣雜交,獲得兩性可育的后代并建立雜交品系的雜交組合相對較少[9]。

減數(shù)分裂是有性生殖生物配子產(chǎn)生的必需過程[10]。目前的研究表明,雜交種不育的主要原因在于其減數(shù)分裂過程中異源染色體配對和分離發(fā)生紊亂。在馬（2n=64）和驢（2n=62）的雜交后代騾中,因其63條染色體在減數(shù)分裂過程中不能進行正常的聯(lián)會,所以敗育[11];在不育的異源三倍體湘云鯽的減數(shù)分裂中,人們同時發(fā)現(xiàn)了單價體和二價體的存在,說明同源染色體在配對和分離過程發(fā)生紊亂[12];此外,在人工三倍體水晶彩鯽發(fā)育阻滯的卵巢中,研究人員也發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂粗線期的細胞中含有單價體、二價體、三價體和其他多價體[13]。因此,是否能跨越減數(shù)分裂阻滯是可育個體形成的重要條件,而雜交物種中來源于不同物種的異源染色體在減數(shù)分裂中的相互識別、聯(lián)會配對和分離尤為困難,更具研究價值。

Dmc1（DNA meiotic recombinase 1）和Rec8（meiotic recombination protein）是減數(shù)分裂過程中與同源染色體配對和分離相關(guān)的重要蛋白質(zhì)。Dmc1基因在減數(shù)分裂前期Ⅰ特異性表達,其產(chǎn)物Dmc1蛋白和RAD51蛋白共同定位于偶線期,在同源染色體配對過程中起到重要作用[14]。Rec8蛋白作用于染色體的著絲粒,在減數(shù)第一次分裂后期,受Sgo1蛋白保護,確保同源染色體分離時姐妹染色單體不分離;在第二次減數(shù)分裂時,Rec8蛋白降解,姐妹染色單體順利分離[15]。在酵母中,Rec8基因作用于減數(shù)分裂過程中的染色體配對和姐妹染色單體的凝集[16]。

團頭魴（Megalobrama amblycephala,2n=48）隸屬于鲌亞科中的魴屬,而翹嘴鲌（Culter alburnus,2n=48）隸屬于鲌亞科中的鲌屬。本課題組以團頭魴和翹嘴鲌為親本,進行屬間正反交,獲得了兩種兩性可育的雜交子一代[17],并通過其自交分別建立了魴鲌雜交品系（BTF1-BTF6）和鲌魴雜交品系（F1-F3）[18～19]。兩性可育雜交子代的形成以及雜交品系的建立在魚類種質(zhì)資源創(chuàng)建方面具有重要的意義。本文在魴鲌雜交品系建立的基礎(chǔ)上,以可育的魴鲌F1為材料,通過對減數(shù)分裂過程中染色體特征、相關(guān)基因序列和表達水平的研究,初步揭示了異源二倍體雜交魚可育的細胞學和遺傳學機制,在魚類遺傳育種方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

團頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F1均取自湖南師范大學淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室。由于雌性個體減數(shù)分裂的不連續(xù)性,即成熟卵子處于減數(shù)第二次分裂中期,受精后才刺激第二次減數(shù)分裂完成,所以本研究選取雄性魴鲌F1作為實驗材料,進行性腺染色體制備;同時,取同一時期的團頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F1精巢組織,用液氮將其速凍后超低溫保存,作為相關(guān)基因檢測的材料。

1.2 性腺染色體制備與觀察

從雄性魴鲌F1的腹腔兩側(cè)取出精巢組織,放入小培養(yǎng)皿中,小心除去結(jié)締組織,用生理鹽水（0.7%的氯化鈉）清洗干凈;用手術(shù)剪將精巢組織剪碎至糊狀,隨后將其全部轉(zhuǎn)移到15 mL尖底離心管中,用吸管猛吹,打散細胞后補足生理鹽水至11 mL;靜置10 min后取上清,離心、取沉淀物,加入0.05 mol/L的氯化鉀低滲液,低滲處理80 min,其間每隔20 min吸取沉淀物并丟棄,低滲處理結(jié)束后離心、收集沉淀物;加入2 mL卡諾氏固定液固定3次,每次固定20 min,固定后離心、取沉淀物,最后加2 mL卡諾氏固定液固定并于4℃保存。吸取20 μL染色體溶液,從高處滴落至冰凍玻片上,于酒精燈上加熱、固定,以吉姆薩染液染色50 min后流水沖洗,晾干。最后,在Olympus光學顯微鏡下觀察染色體形態(tài)并記錄。

1.3 總RNA提取與cDNA第一條鏈合成

從超低溫冰箱取出保存的精巢組織材料,用Trizol（美國ThermoFisher Scientific公司）提取總RNA,具體操作步驟參考試劑說明書。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測新提取的總RNA,確認其是否降解,用酶標儀檢測總RNA的純度和濃度。

檢測合格的RNA經(jīng)DNaseⅠ酶（美國Thermo-Fisher Scientific公司）去除基因組DNA后,用于cDNA第一條鏈的合成,具體合成步驟參照Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo-Fisher Scientific公司）的說明進行。

1.4 Dmc1和Rec8基因編碼區(qū)片段克隆

從NCBI（National Center for Biotechnology Information）公共數(shù)據(jù)庫上查找并下載斑馬魚的Dmc1（NM_001020782）和 Rec8（NM_001040378）基因序列,用BLAST軟件從團頭魴和翹嘴鲌的基因組中調(diào)取相應的Dmc1和Rec8基因片段。為確保序列的準確性,分別設(shè)計引物（表1）,以5條團頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F1精巢組織的cDNA為模板,用高保真酶（美國ThermoFisher Scientific公司）擴增這兩個基因的編碼區(qū)片段,并完成克隆、測序。

表1 Dmc1和Rec8基因的全長擴增與熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for amplification of full-length genes and real-time quantitative PCR

1.5 基因序列比較分析

根據(jù)團頭魴、翹嘴鲌與魴鲌F1的Dmc1和Rec8基因序列,用ClustalW軟件分別比對同源序列,分析并計算Dmc1和Rec8的基因序列與氨基酸序列在團頭魴和翹嘴鲌中的同源性;同時分析團頭魴、翹嘴鲌中這兩個基因在編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點的差異,并進一步利用這些差異的SNP位點,確認魴鲌F1中這兩個基因的遺傳組成情況。

1.6 系統(tǒng)進化分析

從NCBI上 下載斑馬魚、鯽、金線 鲃 等魚類Dmc1和Rec8基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列,將這些序列與團頭魴和翹嘴鲌對應的序列構(gòu)成單獨的文件,利用MEGA 7軟件調(diào)用ClustalW,進行同源氨基酸多序列比對。采用鄰接法（neighborjoining method）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,bootstrap設(shè)置為1 000,其他參數(shù)選擇默認值。

1.7 基因表達檢測

以團頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F1的Dmc1和Rec8基因序列為參考,利用Primer Premier 5軟件在三者均保守的編碼區(qū)域設(shè)計定量PCR引物 （表1）。以團頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F1反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,以管家基因β-Actin作為內(nèi)參,SYBR GreenⅠ（美國ThermoFisher Scientific公司）為 mix,在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量表達分析。反應條件:50℃5 min;95℃10 min;95℃15 s,61℃45 s,40個循環(huán)。實驗重復3次,定量結(jié)果采用2-△△Ct法,用GraphPad Prism 5軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 性腺染色體減數(shù)分裂特征分析

魴鲌F1作為雜交子一代,其異源染色體組包括一套來源于母本團頭魴的染色體和一套來源于父本翹嘴鲌的染色體。通過對魴鲌F1精巢染色體制片結(jié)果的觀察,我們發(fā)現(xiàn)部分分裂相中的48條染色體出現(xiàn)了聯(lián)會配對的現(xiàn)象（圖1A）,具體表現(xiàn)為形態(tài)大小相近的“同源”染色體兩兩配對,以24個二價體的形式存在,推測其為減數(shù)分裂第一次分裂中期的初級精母細胞染色體。此外,我們也發(fā)現(xiàn)少量分裂相僅含有24條染色體,這些染色體均以“X”的形態(tài)存在,即每條染色體上均含有一對姐妹染色單體（圖1B）,推測此為減數(shù)分裂后產(chǎn)生的次級精母細胞染色體。上述結(jié)果說明,盡管魴 鲌 F1中含有兩套來源于不同物種的異源染色體組,但其在減數(shù)分裂過程中能進行正常的染色體配對和分離,形成染色體數(shù)目減半的次級精母細胞。

圖1 魴鲌F1性腺染色體圖（A）第一次減數(shù)分裂中期初級精母細胞中48條異源染色體配對;（B）第二次減數(shù)分裂產(chǎn)生的早期次級精母細胞包含24條“X”形態(tài)染色體。標尺:20 μm。Fig.1 Gonadal chromosome distribution in hybrids of M.amblycephala×C.alburnus（A）Forty-eight chromosomes pairing in primary spermatocytes at metaphase of first meiotic division;（B）Twenty-four chromosomes with the morphology of“X”in early secondary spermatocytes produced by the second meiotic division.Bar:20 μm.

2.2 Dmc1和Rec8的序列比較分析

從團頭魴和翹嘴鲌已有的基因組數(shù)據(jù)中調(diào)取Dmc1和Rec8基因。其中,團頭魴和翹嘴鲌的Dmc1基因編碼區(qū)均為1 029 bp（圖2A）,相似性為99.0%,且均編碼342個氨基酸（圖2C）,氨基酸序列的相似性為99.4%;Rec8基因的編碼區(qū)均為1 713 bp（圖2B）,相似性為98.5%,均編碼570個氨基酸（圖2D）,氨基酸序列的相似性為97.8%。這兩個基因在兩個物種中的相似性極高,但存在明顯的SNP位點差異,故利用這些差異的SNP位點對雜交子代進行基因的遺傳分析。

圖2 團頭魴與翹嘴鲌中Dmc1和Rec8基因的核苷酸及所編碼蛋白質(zhì)的多序列比對結(jié)果（A）Dmc1基因的編碼區(qū)序列比對;（B）Rec8基因的編碼區(qū)序列比對;（C）Dmc1基因所編碼蛋白質(zhì)的多序列比對;（D）Rec8基因所編碼蛋白質(zhì)的多序列比對。Fig.2 The nucleotide and amino acid sequence alignment of Dmc1 and Rec8 genes in M.amblycephala and C.alburnus（A）The nucleotide sequence alignment of Dmc1 gene;（B）The nucleotide sequence alignment of Rec8 gene;（C）The amino acid sequence alignment of Dmc1;（D）The amino acid sequence alignment of Rec8.

分別從5條魴鲌F1的cDNA中克隆Dmc1和Rec8基因并測序,結(jié)果顯示:在測序的Dmc1基因中,50%（14/28）的序列與團頭魴的完全一致,10.71%（3/28）的序列與翹嘴鲌的完全一致,而39.29%（11/28）的序列為重組型序列;在檢測的Rec8基因中,50%（11/22）的序列與團頭魴的完全一致,4.54%（1/22）的序列與翹嘴鲌的完全一致,而45.45%（10/22）的序列為重組型序列。上述結(jié)果表明,Dmc1和Rec8存在較大程度的基因重組,并且魴鲌F1中表達的這兩個基因在結(jié)構(gòu)上更偏向于其母本團頭魴。

2.3 Dmc1和Rec8的系統(tǒng)進化分析

通過構(gòu)建進化樹,我們分析了團頭魴、翹嘴鲌與其他魚類的親緣關(guān)系。結(jié)果如圖3所示,在Dmc1和Rec8基因構(gòu)建的進化樹中,所有的鯉科魚類聚為一支（橙色方框）,其親緣關(guān)系遠高于其他魚類;此外,在鯉科魚類中,團頭魴和翹嘴鲌單獨聚為一支（紅色方框）,其親緣關(guān)系高于其他鯉科魚類,推測其雜交子代可育與其親緣關(guān)系相近有關(guān)。

圖3 Dmc1和Rec8基因的系統(tǒng)進化分析（A）Dmc1基因的進化分析;（B）Rec8基因的進化分析。橙色方框表示鯉科魚類,紅色方框表示團頭魴和翹嘴鲌聚為一支,親緣關(guān)系較近。Fig.3 The phylogenetic analysis of Dmc1 and Rec8 genes（A）The phylogenetic analysis of Dmc1 gene;（B）The phylogenetic analysis of Rec8 gene.The orange boxes highlight cyprinid fish,and red boxes show that the relationship between M.amblycephala and C.alburnus is closer.

2.4 Dmc1和Rec8的基因表達分析

團頭魴、翹嘴鲌及魴鲌F1中Dmc1和Rec8基因的熒光定量檢測結(jié)果如圖4所示,兩個基因均正常表達。在Dmc1表達上,魴鲌F1的表達水平略低于團頭魴和翹嘴鲌,但無顯著性差異（P>0.05）;在Rec8表達上,魴鲌F1與團頭魴之間存在顯著性差異（P<0.05）,但與翹嘴鲌無顯著性差異,且魴鲌F1的表達水平介于團頭魴和翹嘴鲌之間。這些結(jié)果說明,魴鲌F1中Dmc1和Rec8基因的正常表達可能是保證其正常進行減數(shù)分裂的重要原因。

圖4 Dmc1和Rec8基因在團頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F1精巢的表達ns表示無顯著性差異（P>0.05）;**表示有顯著性差異（P<0.05）。Fig.4 The expression of Dmc1和Rec8 genes in the testis of M.amblycephala,C.alburnus and their hybrid fish（BTF1）ns represents no significant difference between BTF1and its parents（P>0.05）;**represents significant difference between BTF1 and its parents（P<0.05）.

3 討論

生殖隔離提出,不同物種間雜交難以獲得存活后代或獲得的雜交后代不可育,如在高等動物中雜種雄性不育是普遍存在的現(xiàn)象[9];而在低等動物中,已有研究證明許多物種都是起源于自然雜交事件[20]。自然界中已有記載的魚類超過32 500種,是脊椎動物中最多的一類[21]。最近的研究表明,很多魚類是通過自然雜交形成的,如:紅鯽[7]和鯉[8]的基因組解析證明,兩者均為包含多套亞基因組的異源多倍體魚,這間接證明了其雜交起源。繁多的種類加上獨特的體外受精方式,使得魚類雜交實驗廣泛進行。在眾多的遠緣雜交組合中,目前人們僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)兩性可育的雜交種[22]。兩性可育的雜交物種是雜交優(yōu)勢在育種工作中延續(xù)的關(guān)鍵,也是雜交品系建立的關(guān)鍵。本課題組利用雌性團頭魴與雄性翹嘴鲌的屬間雜交,獲得了兩性可育的魴鲌雜交魚子一代,并通過其連續(xù)自交建立了魴鲌雜交品系（BTF1-BTF6）,打破了遠緣雜交的生殖障礙,也為探索遠緣雜交的遺傳和繁殖規(guī)律提供了寶貴的研究材料。

目前已有的報道大多是研究雜交種的不育性[23],而雜交種為什么可育的科學問題被研究的相對較少,這可能在于很難獲得可育的雜交種材料。本文對魴鲌F1雜交魚的減數(shù)分裂進行了初步研究。在細胞學方面,制備了魴鲌F1的精巢染色體,觀察到減數(shù)第一次分裂中期存在“同源”染色體配對現(xiàn)象,具體表現(xiàn)為來源于團頭魴和翹嘴鲌的兩套異源染色體形成了24個二價體的形式;同時也觀察到了第一次減數(shù)分裂形成的次級精母細胞的染色體,具體表現(xiàn)為24個“X”形態(tài)染色體。實際上,減數(shù)分裂過程正常進行的關(guān)鍵在于第一次減數(shù)分裂過程中的同源染色體聯(lián)會配對與分離。本研究結(jié)果證明了魴鲌雜交魚能進行正常的第一次減數(shù)分裂,并形成次級精母細胞。張純等[12]在異源四倍體鯽鯉中發(fā)現(xiàn),異源四倍體的染色體在減數(shù)分裂過程中是以100個二價體的形式存在,而不是以25個四價體的形式存在,且未觀察到單價體或多價體的存在;而在三倍體湘云鯽中,除了二價體,未配對的單價體也有存在,因此聯(lián)會紊亂可能是三倍體不育的重要原因。我們推測,魴鲌F1中兩套“同源”染色體在減數(shù)分裂過程中能進行正常的聯(lián)會配對和分離可能是該雜交魚可育的原因之一。

為研究魴鲌雜交魚在減數(shù)分裂中“同源”染色體能正常進行聯(lián)會配對和分離的相關(guān)機制,我們對與減數(shù)分裂有關(guān)的Dmc1和Rec8基因進行了相關(guān)研究。雖然這兩個基因是在酵母中發(fā)現(xiàn)的,但目前的報道已確認其在魚類的減數(shù)分裂過程中也起到重要的作用[24～26]。本文對Dmc1和Rec8的結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化及表達水平進行了分析。結(jié)果顯示,在團頭魴和翹嘴鲌之間,這兩個基因的序列相似性極高,兩者的親緣關(guān)系最近,并且雜交魚中的基因表達未見異常,推測魴鲌雜交魚可育的主要原因是其能夠順利地進行減數(shù)分裂過程,即能進行正常的減數(shù)分裂調(diào)控。根據(jù)以上結(jié)果,我們推測團頭魴和翹嘴鲌的雜交后代可育是由于其關(guān)鍵基因間具有高度的相似性。在減數(shù)分裂過程中,那些差異的SNP位點不影響基因的正常表達和蛋白質(zhì)的相互識別與作用,異源基因之間可能能夠互相調(diào)控,從而共同推進減數(shù)分裂的進程。

綜上所述,本研究制備了異源二倍體雜交魴鲌F1的性腺染色體,觀察到明顯的異源染色體配對形成二價體,并分離形成含有單價體的次級精母細胞,直接證明了異源二倍體雜交魴鲌能夠進行正常的“同源”染色體配對和分離,這可能是魴鲌雜交魚能夠進行正常減數(shù)分裂的原因之一。此外,本文對在減數(shù)分裂過程中起重要作用的Dmc1和Rec8基因的序列、表達及系統(tǒng)進化進行了分析,揭示了其在團頭魴和翹嘴鲌這兩個物種中具有極高的相似性,這可能是魴鲌雜交魚能夠進行正常減數(shù)分裂的另一個重要原因?？偟膩碇v,本文初步探討了魴鲌雜交魚染色體減數(shù)分裂過程的特征及相關(guān)基因的表達情況,為揭示雜交品系形成乃至雜交物種形成提供了重要的證據(jù),同時也將為雜交育種工作提供重要的理論指導。