彭彥皓,肖 樹(shù),陳 麗,姚昱祺,張?jiān)讫?陸昌瑞,陳 婷

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,中國(guó)上海 201620）

胰島素降解酶（insulin degrading enzyme,IDE）是一種高度保守并且廣泛表達(dá)的鋅離子金屬蛋白酶,因可以快速降解胰島素而被發(fā)現(xiàn)[1]。IDE在人、鼠、果蠅、細(xì)菌等多種生物體內(nèi)都有表達(dá),并具有較高的同源性[2]。不僅如此,IDE在機(jī)體中的分布也十分廣泛,包括肝、胰腺、腎、脾、肺、心、肌肉、腦、睪丸、卵巢、脂肪等組織[3]。其中,肝內(nèi)IDE的活性最高,腎、大腦和肌肉組織中的IDE活性次之。在亞細(xì)胞層面,盡管IDE一直被認(rèn)為是細(xì)胞溶質(zhì)蛋白[4],但后續(xù)研究表明它在幾乎所有亞細(xì)胞區(qū)室中都有表達(dá)[5]。另外,IDE雖然被稱為胰島素降解酶,但其還擁有降解胰高血糖素、胰島淀粉素、β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein,Aβ）、α-突觸核蛋白、HIV-1 p6蛋白以及胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ（insulin-like growth factor-Ⅱ,IGF-Ⅱ）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α （transforming growth factor-α,TGF-α）等眾多底物的能力[6～7]。這表明IDE在機(jī)體內(nèi)參與了多種生物功能的調(diào)節(jié),具有極為重要的生理意義。

經(jīng)全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study,GWAS）及生物信息學(xué)分析,IDE被證明與2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM）和阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）有關(guān)[8～11],雖然其中的作用機(jī)理尚不清晰,但這預(yù)示了一個(gè)可以治療AD與T2DM的全新潛在途徑。這足以激起學(xué)者們對(duì)IDE在生物體內(nèi)的作用及其機(jī)理研究的興趣,目前眾多針對(duì)IDE結(jié)構(gòu)的研究集中于其對(duì)底物的降解機(jī)理[12～17]和二聚化、多聚化等變構(gòu)現(xiàn)象[18～22],并期望于通過(guò)了解IDE的結(jié)構(gòu)及機(jī)理,發(fā)現(xiàn)影響IDE活性的途徑,從而達(dá)到治療或預(yù)防AD與T2DM的目的。

隨著針對(duì)IDE研究的深入,學(xué)者們逐漸集中于研究如何調(diào)節(jié)IDE降解其兩個(gè)主要底物Aβ和胰島素的活性來(lái)治療或改善AD和T2DM[23～25],與此同時(shí),眾多通過(guò)抑制劑或激活劑來(lái)改變IDE活性的研究被報(bào)道[26～35],并成功證明通過(guò)抑制IDE對(duì)胰島素的降解可改善小鼠的糖耐受性,這為日后針對(duì)IDE降解活性的特異性調(diào)節(jié)劑的開(kāi)發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究成功構(gòu)建了野生型鼠源胰島素降解酶（mouse insulin degrading enzyme,mIDE）的體外表達(dá)系統(tǒng),并對(duì)mIDE體外表達(dá)及純化條件進(jìn)行了摸索。實(shí)驗(yàn)選用了具有增加外源蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)特點(diǎn)的ppSUMO載體,減少了mIDE不溶包涵體的出現(xiàn);同時(shí),利用His-SUMO標(biāo)簽可以被特異性切除的優(yōu)勢(shì),使純化得到的mIDE不殘留任何人工插入的氨基酸序列。所表達(dá)的mIDE經(jīng)已發(fā)表的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中用于酶活性測(cè)定的特異性熒光底物 Mca-RPPGFSAFK（Dnp）[32～33]檢測(cè),具有 mIDE正常酶活性;經(jīng)已報(bào)道的IDE抑制劑楊梅素（myricetin）[26]檢測(cè),其對(duì)抑制劑的響應(yīng)與該報(bào)道中所示基本一致。該方法的建立為后續(xù)mIDE的靶向分子研究及機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

ppSUMO質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）、mIDE基因均為實(shí)驗(yàn)室自有;質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、鎳柱、硝酸纖維素膜、Pfu DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、TureColor三色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、T4 DNA連接酶、PCR引物、DNA測(cè)序服務(wù)等均購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ購(gòu)于New England Biolabs公司（美國(guó)）;6*His標(biāo)簽單克隆抗體購(gòu)于Proteintech 公司（美國(guó)）;PageRulerTMUnstained Broad Range Protein Ladder購(gòu)于ThermoFisher公司（美國(guó)）;Hitrap Q FF 5 mL離子交換柱、HiLoad 16/60 Superdex 200 pg凝膠層析柱購(gòu)于GE Healthcare公司（美國(guó)）;Mca-RPPGFSAFK（Dnp）熒光底物購(gòu)于Sigma公司（美國(guó)）;楊梅素購(gòu)于Aladin公司（美國(guó)）。

1.2 溶液的配制

mIDE蛋白緩沖液:稱取3.05 g Tris base和29.5 g NaCl于超純水中,加入50 mL丙三醇,調(diào)節(jié)pH至8.0,而后定容至1 L,過(guò)濾除菌后4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

mIDE酶活反應(yīng)緩沖液:稱取3.05 g Tris base和29.5 g NaCl于超純水中,加入50 mL丙三醇,調(diào)節(jié)pH至7.3,而后定容至1 L,過(guò)濾除菌后放于4℃?zhèn)溆谩?/p>

熒光底物溶液:將1 mg Mca-RPPGFSAFK（Dnp）加入0.16 mL的DMSO,溶解后置于-20℃避光保存。

1.3 ppSUMO-mIDE全長(zhǎng)基因片段重組質(zhì)粒的克隆構(gòu)建

以mIDE的cDNA全長(zhǎng)序列為模板、mIDE-F和mIDE-R為前后引物（表1）,利用Pfu DNA聚合酶在特定PCR反應(yīng)條件（表2）下進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)所得PCR產(chǎn)物及抽提所得的ppSUMO質(zhì)粒進(jìn)行純化,而后使用BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,再利用T4 DNA連接酶連接酶切產(chǎn)物,完成質(zhì)粒構(gòu)建。獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定后,用于蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

表2 PCR反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction conditions

1.4 mIDE的表達(dá)與純化

融合蛋白His-SUMO-mIDE的表達(dá):將測(cè)序正確的ppSUMO-mIDE全長(zhǎng)基因片段重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆接種于含5 mL LB培養(yǎng)液的搖菌管中,加入5 μL卡那霉素（50 mg/mL）,放于37℃、225 r/min搖床中過(guò)夜培養(yǎng)。次日,將搖床培養(yǎng)的菌液按1︰1 000的比例接種于含有終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)液（1 L）搖瓶中,放入37℃、225 r/min的搖床中培養(yǎng),直至OD600達(dá)到0.5～0.8后取出。向其中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG;終濃度為0.5 mmol/L）,而后在16℃、225 r/min的搖床中過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。次日,在4℃條件下4 000 r/min離心30 min,收集菌體,用mIDE蛋白緩沖液按1 g/10 mL的比例重懸菌體,并按照1︰100的體積比加入100 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF）,而后通過(guò)高壓細(xì)胞破碎儀將細(xì)胞在1 300 bar、4℃條件下破碎。將破碎后的懸濁液置于高速低溫離心機(jī)中,于4℃條件下14 000 r/min離心1 h,獲得含有融合蛋白的上清液。

鎳柱親和純化:向預(yù)先用mIDE蛋白緩沖液平衡過(guò)的鎳柱中加入含有融合蛋白的上清液樣品,收集穿出液并重復(fù)上柱1～2次;依次用至少5～10倍柱床體積的含20 mmol/L、30 mmol/L咪唑的蛋白緩沖液對(duì)雜蛋白進(jìn)行漂洗;而后依次用至少5～10倍柱床體積的含250 mmol/L、500 mmol/L咪唑的蛋白緩沖液對(duì)融合蛋白進(jìn)行洗脫。將含有目標(biāo)融合蛋白的樣品進(jìn)行濃縮,采用30 kD的超濾管進(jìn)行緩沖液的置換,去除咪唑并濃縮至5 mL左右。加入1 μL的ULP1酶,4℃過(guò)夜切除標(biāo)簽。次日,將酶切后的樣品加入預(yù)先用不含咪唑的蛋白緩沖液平衡后的鎳柱中,進(jìn)行二次過(guò)柱,以便吸附ULP1酶及其切割下來(lái)的His-SUMO標(biāo)簽,收集穿出液,再次利用30 kD的超濾管對(duì)無(wú)標(biāo)簽的mIDE蛋白進(jìn)行濃縮（濃縮至250 μL）,隨后用液氮凍存于-80℃,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)并鑒定誘導(dǎo)表達(dá)及親和純化過(guò)程中的蛋白質(zhì)樣品。

離子交換層析純化:采用AKTA FPLC系統(tǒng),選取Hitrap Q FF 5 mL離子交換柱,以連續(xù)洗脫方式進(jìn)一步純化無(wú)標(biāo)簽的mIDE蛋白。A泵為不含NaCl的蛋白緩沖液,B泵為含1 mol/L NaCl的蛋白緩沖液。洗脫程序?yàn)锽泵混合濃度從0%～80%線性增長(zhǎng),流速為0.5 mL/min,按每管1 mL進(jìn)行樣品收集。采用SDS-PAGE檢測(cè)洗脫樣品,并對(duì)含有mIDE蛋白的樣品進(jìn)行低溫超濾管（30 kD）濃縮,濃縮樣品用液氮凍存于-80℃冰箱中以備后用。

凝膠過(guò)濾層析純化:采用AKTA FPLC系統(tǒng),選取HiLoad 16/60 Superdex 200 pg柱,程序設(shè)定為0.5 mL/min,用蛋白緩沖液進(jìn)行洗脫。收集的蛋白質(zhì)樣品用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)含有mIDE蛋白的樣品進(jìn)行低溫超濾管（30 kD）濃縮,并用液氮凍存于-80℃冰箱中以備后用。采用Image Lab軟件檢測(cè)蛋白質(zhì)純度,利用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.5 目的蛋白檢測(cè)

按1︰4的體積比將收集的蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合,而后95℃加熱3 min。用12%的SDS-PAGE及Western-blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)及純化效果,利用Image Lab軟件測(cè)定蛋白質(zhì)純度,采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE的條件為190 V、45 min,采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色;Western-blot的條件為80 mA、90 min,轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉在4℃條件下封閉1 h,而后用6*His標(biāo)簽單克隆抗體孵育1 h,經(jīng)PBST沖去多余抗體后,ECL發(fā)光檢測(cè)。

1.6 mIDE的活性測(cè)定

Mca-RPPGFSAFK（Dnp）是IDE的一種熒光底物,在被IDE酶解后可經(jīng)320 nm光激發(fā),發(fā)射出405 nm熒光,利用酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度,即可反映IDE的酶活性。酶活反應(yīng)體系:mIDE 1 μL（4nmol/L）、Mca-RPPGFSAFK（Dnp）1μL（5 μmol/L）、酶活反應(yīng)緩沖液補(bǔ)至100 μL。將配好的酶活反應(yīng)體系對(duì)應(yīng)加入Corning 96孔板,振蕩搖勻后迅速放入Molecular Devices公司所產(chǎn)的FlexStationⅡ多功能酶標(biāo)儀,在37℃條件下讀取酶活反應(yīng)體系熒光信號(hào)1 h左右,讀取速度為fast,sensitivity為1。觀察結(jié)果并記錄數(shù)據(jù)。

1.7 質(zhì)粒抽提、PCR產(chǎn)物純化以及DNA膠回收與樣品檢測(cè)

質(zhì)粒抽提、PCR產(chǎn)物純化與DNA膠回收均參照上海生工生物工程股份有限公司所提供試劑盒的操作步驟進(jìn)行。

將純化所得樣品按1︰4的體積比與試劑盒中所提供上樣緩沖液相混合,而后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)抽提質(zhì)粒或PCR產(chǎn)物,電泳條件為140 V、20 min,在成像儀中觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 ppSUMO-mIDE全長(zhǎng)基因片段重組質(zhì)粒的克隆構(gòu)建

以已知的mIDE蛋白的cDNA全長(zhǎng)序列為模板,利用合成的mIDE-F和mIDE-R為引物,成功擴(kuò)增出大小為3 060 bp的mIDE全長(zhǎng)基因片段（圖中簡(jiǎn)寫為mide）（圖1A）,其條帶較為明顯,進(jìn)行DNA膠回收后即可進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建。圖1B為抽提的ppSUMO質(zhì)粒,條帶清晰且單一,可直接用于質(zhì)粒構(gòu)建。圖1 C是目的基因片段與ppSUMO質(zhì)粒重組后的檢測(cè)結(jié)果,可以看出ppSUMO-mIDE全長(zhǎng)基因片段重組質(zhì)粒條帶清晰,經(jīng)測(cè)序檢測(cè),序列完全正確,可進(jìn)行后續(xù)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖1 mIDE全長(zhǎng)基因片段的獲取與重組質(zhì)粒構(gòu)建（A）mIDE蛋白全長(zhǎng)基因片段的PCR擴(kuò)增。1:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),2:mIDE全長(zhǎng)基因片段（mide）;（B）ppSUMO質(zhì)粒抽提檢測(cè)。1:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),2:ppSUMO質(zhì)粒;（C）ppSUMO-mIDE全長(zhǎng)基因片段重組質(zhì)粒抽提檢測(cè)。1:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),2:pp-SUMO-mIDE全長(zhǎng)基因片段重組質(zhì)粒。Fig.1 Acquisition of the mIDE full-length gene and plasmid construction（A）PCR amplification of mIDE target fragment.1:DNA marker,2:mIDE full-length gene fragment;（B）ppSUMO plasmid extraction and detection.1:DNA marker,2:ppSUMO plasmid;（C）ppSUMO-mIDE plasmid extraction and detection.1:DNA marker,2:ppSUMO-mIDE plasmid.

2.2 mIDE的表達(dá)與純化

在 16℃、225 r/min、0.5 mmol/L IPTG 的條件下,過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白His-SUMO-mIDE。從圖2A的結(jié)果可知,在該誘導(dǎo)表達(dá)條件下,融合蛋白表達(dá)較好,且多為可溶性表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-blot檢測(cè),結(jié)果顯示,融合蛋白產(chǎn)生了多條降解條帶（大小約為20 kD、50 kD和70 kD）,推測(cè)目的蛋白容易在結(jié)構(gòu)域N和C之間發(fā)生斷裂,或發(fā)生His-SUMO標(biāo)簽的脫落（圖2B）。

利用His-SUMO標(biāo)簽進(jìn)行融合蛋白的鎳柱親和純化。先將含有融合蛋白的上清液樣品重復(fù)上柱1～2次,隨后依次使用含20 mmol/L、30 mmol/L咪唑的蛋白緩沖液對(duì)雜蛋白進(jìn)行漂洗,最后依次用含250 mmol/L、500 mmol/L咪唑的蛋白緩沖液對(duì)融合蛋白進(jìn)行洗脫。盡管破菌上清液樣品中的融合蛋白含量不高,但鎳柱純化仍得到了較多目標(biāo)融合蛋白（圖3）。結(jié)合圖2B結(jié)果可知,大部分的雜蛋白在20 mmol/L咪唑洗滌的條件下被除去,在250 mmol/L咪唑條件下,目標(biāo)融合蛋白被洗脫下來(lái)。濃縮后,融合蛋白量可以接近50%。

圖2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)（A）融合蛋白初步誘導(dǎo)表達(dá)的12%SDS-PAGE檢測(cè)。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),2:誘導(dǎo)表達(dá)前的樣品,3:誘導(dǎo)表達(dá)后的樣品;（B）融合蛋白初步誘導(dǎo)表達(dá)的Western-blot檢測(cè)。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),2:誘導(dǎo)表達(dá)前的樣品,3:誘導(dǎo)表達(dá)后的樣品。Fig.2 The results of induced expression of mIDE fusion protein（A）12%SDS-PAGE detection of preliminary induced expression of mIDE fusion protein.1:Protein marker,2:Sample before induction,3:Sample after induction;（B）Western-blot detection of preliminary induced expression of mIDE fusion protein.1:Protein marker,2:Sample before induction,3:Sample after induction.

圖3 融合蛋白的鎳柱親和純化（A）鎳柱親和純化的12%SDS-PAGE檢測(cè)。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),2:誘導(dǎo)前的樣品,3:誘導(dǎo)后的樣品,4:破菌離心后的上清液樣品,5:破菌離心后的沉淀樣品,6:上柱后穿出樣品,7:20 mmol/L咪唑洗滌樣品,8:30 mmol/L咪唑洗滌樣品,9:250 mmol/L咪唑洗脫樣品,10:500 mmol/L咪唑洗脫樣品,11:濃縮樣品;（B）鎳柱親和純化的Western-blot檢測(cè)。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),2:誘導(dǎo)前的樣品,3:誘導(dǎo)后的樣品,4:破菌離心后的上清液樣品,5:破菌離心后的沉淀樣品,6:上柱后穿出樣品,7:20 mmol/L咪唑洗滌樣品,8:30 mmol/L咪唑洗滌樣品,9:250 mmol/L咪唑洗脫樣品。Fig.3 The results of affinity purification of the fusion protein on nickel column（A）12%SDS-PAGE detection after nickel column affinity purification.1:Protein marker,2:Sample before induction,3:Sample after induction,4:Supernatant after bacteriostasis and centrifugation,5:Precipitation after bacteriostasis and centrifugation,6:Sample passing through the column,7:20 mmol/L imidazole washing sample,8:30 mmol/L imidazole washing sample,9:250 mmol/L imidazole eluent sample,10:500 mmol/L imidazole eluent sample,11:Concentrated sample;（B）Western-blot detection after nickel column affinity purification.1:Protein marker,2:Sample before induction,3:Sample after induction,4:Supernatant after bacteriostasis and centrifugation,5:Precipitation after bacteriostasis and centrifugation,6:Sample passing through the column,7:20 mmol/L imidazole washing sample,8:30 mmol/L imidazole washing sample,9:250 mmol/L imidazole eluent sample.

融合蛋白的His-SUMO標(biāo)簽有ULP1酶識(shí)別位點(diǎn),因此可以用ULP1酶切除His-SUMO標(biāo)簽,得到無(wú)標(biāo)簽的mIDE蛋白。由圖4A可以看出,經(jīng)過(guò)4℃過(guò)夜的ULP1酶酶切,大部分融合蛋白已被切除His-SUMO標(biāo)簽。將經(jīng)ULP1酶降解后的樣品再次通過(guò)鎳柱,除去ULP1酶和His-SUMO標(biāo)簽。從圖4B可知,純化后mIDE與標(biāo)簽His-SUMO、未完全酶切的融合蛋白及ULP1分離。將包含目標(biāo)蛋白質(zhì)的樣品進(jìn)行濃縮用于后續(xù)純化。濃縮樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度約為3.2 mg/mL。

圖4 融合蛋白的ULP1酶切結(jié)果（A）融合蛋白經(jīng)ULP1酶切和鎳柱親和純化后的12%SDS-PAGE檢測(cè)。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),2:酶切前的樣品,3:酶切后的樣品;（B）融合蛋白經(jīng)ULP1酶切和鎳柱親和純化后的Western-blot檢測(cè)。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),2:酶切前的樣品,3:酶切后的樣品。Fig.4 ULP1 digestion of mIDE fusion protein（A）12%SDS-PAGE detection of affinity purification of mIDE on nickel column after fusion protease digestion.1:Protein marker,2:Sample before digestion,3:Sample after digestion;（B）Western-blot detection of affinity purification of mIDE on nickel column after fusion protease digestion.1:Protein marker,2:Sample before digestion,3:Sample after digestion.

野生型mIDE的等電點(diǎn)（pI）為6.08,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所在緩沖液pH為8.0時(shí),mIDE整體帶負(fù)電,利用這種性質(zhì),可以采用離子交換層析法對(duì)前述純化的mIDE進(jìn)行進(jìn)一步的純化。文中選用GE Healthcare的Hitrap Q FF強(qiáng)陰離子交換柱進(jìn)行純化,通過(guò)NaCl梯度洗脫,將目的蛋白與雜蛋白進(jìn)行分離純化。層析過(guò)程如圖5A所示。采用SDSPAGE檢測(cè)洗脫樣品,圖5B中的泳道2～15對(duì)應(yīng)圖5A中20～90 mL收集的等間隔樣品,其中2～10號(hào)泳道對(duì)應(yīng)20～60 mL樣品,11～15號(hào)泳道對(duì)應(yīng)60～90 mL樣品。從電泳結(jié)果（圖5B）可知,在第4～10泳道,大量相對(duì)分子質(zhì)量約50 kD的雜蛋白被洗脫下來(lái);在第9～15泳道,大量目的蛋白mIDE（117 kD）被洗脫,但同時(shí),部分70 kD的雜蛋白也隨之被洗脫下來(lái),收集此部分樣品以備后續(xù)純化使用。離子交換層析法所得樣品的純度在75%左右,質(zhì)量濃度為340 μg/mL。

圖5 mIDE離子交換層析結(jié)果（A）離子交換層析圖譜（GE Healthcare Hitrap Q FF 5 mL強(qiáng)陰離子交換柱,25 mmol/L Tris,5%甘油,pH 8.0,0.5 mL/min,0～800 mmol/L NaCl梯度洗脫）;（B）離子交換層析樣品的12%SDS-PAGE檢測(cè)。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),2～15:離子交換層析中收集的樣品（收集自20～90 mL洗脫樣品）。Fig.5 The results of mIDE ion exchange chromatography（A）Ion exchange chromatogram（GE Healthcare Hitrap Q FF 5 mL strong anion exchange column,25 mmol/L Tris,5%glycerol,pH 8.0,0.5 mL/min,0～800 mmol/L NaCl gradient elution）;（B）12%SDS-PAGE detection of ion exchange chromatography samples.1:Protein marker,2～15:Samples collected by ion exchange chromatography（collected from 20～90 mL elution samples）.

因離子交換層析法得到的目標(biāo)蛋白質(zhì)中依然混有大量70 kD雜蛋白,所以利用凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化。凝膠過(guò)濾層析主要利用不同蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量差異對(duì)其進(jìn)行分離純化。離子交換層析純化所得mIDE的大小為117 kD,與70 kD雜蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量差異較大,故進(jìn)一步選用HiLoad 16/60 Superdex 200 pg凝膠過(guò)濾層析柱對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。該層析柱的分離范圍為10～600 kD,柱床體積為120 mL,純化過(guò)程中選用0.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。層析結(jié)果如圖6A所示,間隔收集圖中60 mL至90 mL的樣品,進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。從圖6B可以看出,mIDE在第2～8泳道（對(duì)應(yīng)洗脫體積為65～74 mL）被洗脫下來(lái),隨后70 kD的雜蛋白在第9～14泳道（對(duì)應(yīng)洗脫體積為75～90 mL）被洗脫下來(lái);二者相差較近,仍有部分條帶重合。收集1～6號(hào)樣品進(jìn)行濃縮,以備后續(xù)活性檢測(cè);濃縮后目標(biāo)蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為84 μg/mL,純度約為90%。

圖6 mIDE凝膠過(guò)濾層析結(jié)果（A）凝膠過(guò)濾層析圖譜（HiLoad 16/60 Superdex 200 pg 120 mL凝膠過(guò)濾柱,25 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,5%甘油,pH 8.0,0.5 mL/min）;（B）凝膠過(guò)濾層析樣品的12%SDS-PAGE檢測(cè)。1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),2～14:凝膠過(guò)濾樣品（收集自60～90 mL洗脫樣品）。Fig.6 The results of mIDE gel filtration chromatography（A）Gel filtration chromatogram（HiLoad 16/60 Superdex 200 pg 120 mL gel filtration column,25 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,5%glycerol,pH 8.0,0.5 mL/min）;（B）12%SDS-PAGE detection of gel filtration chromatography.1:Protein marker,2～14:Gel filtration samples（collected from 60～90 mL elution samples）.

2.3 mIDE的活性測(cè)定

酶活反應(yīng)體系為100 μL,mIDE加入體系后終濃度為4 nmol/L,Mca-RPPGFSAFK（Dnp）底物濃度為5 μmol/L,37℃反應(yīng)50 min后,檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化,激發(fā)光為320 nm,發(fā)射光為405 nm。圖7A結(jié)果顯示,野生型mIDE在30 min內(nèi)的熒光強(qiáng)度快速上升,而后逐漸趨于平緩,在66 min左右達(dá)到最高點(diǎn)。采用雙倒數(shù)作圖法估算mIDE的最大反應(yīng)速度vmax為1 111.111 RFU/min,Km值為6.222 μmol/L（圖7B）,這與文獻(xiàn)報(bào)道的體外活性[26]較為接近,說(shuō)明該體外表達(dá)純化體系得到的mIDE具有良好的生物活性。

經(jīng)查閱mIDE抑制劑相關(guān)文獻(xiàn)[26～35],選用其中已報(bào)道的mIDE小分子抑制劑楊梅素[26],檢測(cè)本文方法所制備的mIDE對(duì)抑制劑的響應(yīng)情況,結(jié)果如圖7 C所示,從中可以明顯看出,在30 μmol/L楊梅素存在下,mIDE對(duì)熒光底物的降解效率明顯降低。隨后,保持mIDE濃度與底物濃度不變,梯度增加楊梅素的濃度,觀察mIDE隨抑制劑濃度增加的底物降解效率的改變,并利用Origin軟件中的logistic函數(shù)進(jìn)行非線性擬合,得到楊梅素的IC50值約為24 μmol/L（圖7 D）。上述結(jié)果顯示,楊梅素對(duì)mIDE展現(xiàn)出了較高的抑制效果,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[26]相符,這從另一方向印證了本方法獲得的mIDE具有正常的生理活性并可用于后續(xù)的結(jié)構(gòu)功能檢測(cè)。

圖7 mIDE活性檢測(cè)結(jié)果（A）mIDE的活性檢測(cè)圖。數(shù)據(jù)均為3次實(shí)驗(yàn)所得平均值;（B）mIDE酶活反應(yīng)米氏方程雙倒數(shù)圖。mIDE與1 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、9 μmol/L的熒光底物分別混合,用終點(diǎn)法測(cè)量并繪制mIDE速率與底物濃度的雙倒數(shù)圖;（C）楊梅素對(duì)mIDE酶活的抑制效果。數(shù)據(jù)均為3次實(shí)驗(yàn)所得平均值;（D）楊梅素對(duì)mIDE的IC50值測(cè)定。mIDE與不同濃度的楊梅素抑制劑分別混合,用終點(diǎn)法測(cè)量并繪制mIDE活性與抑制劑濃度的非線性擬合圖。Fig.7 The results of mIDE activity test（A）The activity detection of mIDE.The data are the average values of 3 experiments;（B）The double reciprocal graph of mIDE rate and substrate concentration.mIDE and 1 μmol/L,3 μmol/L,6 μmol/L,9 μmol/L fluorescent substrates were separately mixed and measured,using the endpoint method;（C）The myricetin inhibitory activity detection of mIDE.The data are the average values of 3 experiments;（D）The nonlinear fit graph of mIDE activity and inhibitor concentration.mIDE and different concentrations of myricetin inhibitor were mixed and determined separately,using the endpoint method.

3 討論

AD是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,是一種在中老年中極為常見(jiàn)的疾病。針對(duì)AD的研究在百余年間從未間斷,但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。同樣,T2DM的相關(guān)研究也面臨著類似的科學(xué)困難,其作為一種常見(jiàn)的激素失調(diào)型疾病,目前的發(fā)病機(jī)制仍不清晰,治療途徑亦不明朗。隨著近些年來(lái)的研究發(fā)展,IDE在機(jī)體糖代謝調(diào)節(jié)與有毒物質(zhì)清除方面的能力吸引了眾多學(xué)者的目光。其在體內(nèi)所承擔(dān)的功能對(duì)AD和T2DM的發(fā)病及治療過(guò)程均有著極為重要的作用,并有著潛在的疾病治療靶點(diǎn)的重要價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)獲取mIDE蛋白的全長(zhǎng)基因片段序列,構(gòu)建了大腸桿菌ppSUMO體外表達(dá)系統(tǒng)（圖1）;通過(guò)其高效可溶的特點(diǎn),進(jìn)行了野生型mIDE的體外表達(dá)及純化。實(shí)驗(yàn)中,利用His-SUMO標(biāo)簽的優(yōu)勢(shì),在ULP1酶和鎳柱親和純化之后,成功獲取到不含外源標(biāo)簽的野生型mIDE（圖3～4）,排除了殘留標(biāo)簽對(duì)mIDE可能存在的影響。但由于樣品中的蛋白質(zhì)較為復(fù)雜多樣,且根據(jù)圖4B可以看出mIDE在表達(dá)過(guò)程中存在不同程度的降解,所以需要結(jié)合離子交換層析與分子篩層析對(duì)樣品開(kāi)展進(jìn)一步的純化。為確定后續(xù)純化方法,通過(guò)ExPASy網(wǎng)站對(duì)融合蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)性質(zhì)預(yù)測(cè),根據(jù)其等電點(diǎn)和預(yù)實(shí)驗(yàn),選用Hitrap Q FF強(qiáng)陰離子交換柱進(jìn)行純化（圖5）。根據(jù)離子交換層析結(jié)果可以看出,目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離效果較好,但仍存在一定的優(yōu)化空間,可以更進(jìn)一步對(duì)梯度洗脫策略進(jìn)行調(diào)整,從而加大分離效果,在離子交換層析部分得到更好的純化效果。在分子篩層析中,利用HiLoad 16/60 Superdex 200 pg對(duì)mIDE和雜蛋白進(jìn)行最終的分離純化。從圖6中可以看出,通過(guò)本實(shí)驗(yàn)方案,目的蛋白與70 kD左右的雜蛋白得到良好的分離,且最終可以得到純度在90%以上的樣品,為繼續(xù)進(jìn)行更深層次的mIDE研究奠定了基礎(chǔ)。此外,本次實(shí)驗(yàn)還以Mca-RPPGFSAFK（Dnp）為反應(yīng)底物,通過(guò)構(gòu)建體外熒光酶活檢測(cè)體系,建立了驗(yàn)證mIDE活性的方法,為mIDE的蛋白質(zhì)工程改造或者后續(xù)抑制劑、激活劑的尋找和對(duì)比提供了實(shí)用的檢測(cè)方案。

綜上可知,本實(shí)驗(yàn)基于IDE已知的結(jié)構(gòu)與功能,根據(jù)其理化性質(zhì),運(yùn)用親和層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等方法成功分離純化出野生型mIDE;同時(shí),利用特異熒光底物和IDE已知抑制劑對(duì)分離純化的mIDE進(jìn)行了活性檢測(cè),結(jié)果顯示采用該方法制備的mIDE具有較好的活性。本研究所建立的方法,為IDE小分子化合物的有目的篩選、IDE有效調(diào)控分子的獲取提供了基礎(chǔ),對(duì)研究AD或糖尿病的新型療法具有重要意義。在后續(xù)的工作中,課題組將進(jìn)一步嘗試使用X晶體衍射技術(shù)或小角散射技術(shù)對(duì)獲得的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-藥物分子復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,以期獲得更多結(jié)構(gòu)信息,為IDE的蛋白質(zhì)工程改造及小分子化合物篩選提供更多信息。