楊曉峰，王倩倩，田濤

前列腺癌(PCa)是全世界公認(rèn)的老年男性惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率較高，被列為第三大常見的致命癌癥之一[1-3]。PCa早期缺乏特異性生物標(biāo)志物導(dǎo)致診斷較難。因此，深入研究PCa中潛在的分子機(jī)制對(duì)PCa診治具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是一組長(zhǎng)度大于200 nt的轉(zhuǎn)錄物，沒有蛋白質(zhì)編碼動(dòng)能[4]。既往研究顯示，lncRNAs為多種癌細(xì)胞凋亡機(jī)制中的重要調(diào)節(jié)因子[5-7]。LINC01006在PCa發(fā)病中的作用機(jī)制仍不清楚。lncRNAs作為一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(ceRNA)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也可作為miRNAs調(diào)節(jié)mRNAs的海綿吸附作用[8-10]。本文研究LINC01006在PCa中的ceRNA調(diào)控機(jī)制，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 資料 選取2016年1月—2020年6月本院確診并進(jìn)行前列腺癌根治術(shù)治療的患者34例為研究對(duì)象，年齡44～78( 64.75±8.04) 歲。納 入 標(biāo) 準(zhǔn):(1)經(jīng)病理確診為前列腺癌;(2)臨床及隨訪資料完整;(3)行手術(shù)治療;(4)本人及家屬知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)非新發(fā)前列腺癌患者;(2)合并糖尿病、高血壓、冠心病等疾病的患者;(3)其他惡性腫瘤患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 材料 人正常細(xì)胞系(RWPE-1)和DU145、PC3、LNCAP及VCaP 4種人PCa細(xì)胞系均來自美國典型菌種保藏中心ATCC (Manassas, VA)。將所有細(xì)胞置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。LINC01006的shRNA及相應(yīng)的對(duì)照shRNA質(zhì)粒均由Genechem公司(中國 上海)合成。miR-34a-5p模擬物/抑制劑和NC模擬物/抑制劑購自RiboBio公司(中國 上海)。TRIzol試劑(Invitrogen, USA)分離總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT master mix (Takara, Tokyo, Japan)合成cDNA。BeyoClick EdU-594細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒來自Beyotime公司(中國 上海)。TUNEL試劑使用Merck KGaA(Darmstadt, Germany)。基質(zhì)凝膠使用BD Biosciences(San Diego, CA, USA)。BALB/c裸鼠(5～6周齡)來自SLRC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(中國 上海)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 將pcDNA3.1載體(Invitrogen)用LINC01006亞克隆過表達(dá)，空pcDNA3.1載體作為陰性對(duì)照。所有細(xì)胞轉(zhuǎn)染均使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen)。

1.3.2 總RNA提取及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 使用TRIzol試劑分離總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。應(yīng)用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行qPCR測(cè)定分子表達(dá)水平。分別以U6、GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，再用2-△△Ct法計(jì)算結(jié)果。

1.3.3 集落形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中孵育2周。4% PFA固定30 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液染色5 min，最后手工記錄可見集落。

1.3.4 EdU實(shí)驗(yàn) 使用細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒進(jìn)行EdU增殖測(cè)定。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔在96孔板中培養(yǎng)。 使用EdU和DAPI溶液進(jìn)行雙重染色后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.3.5 TUNEL檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染的DU145和LNCAP細(xì)胞用4%的PFA處理，然后加入TUNEL試劑，DAPI染料染色后，使用光學(xué)顯微鏡對(duì)標(biāo)記的樣品進(jìn)行分析。

1.3.6 流式細(xì)胞儀 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。用結(jié)合緩沖液雙重染色15 min后，用流式細(xì)胞儀(FACScan，BD Biosciences)測(cè)定細(xì)胞樣品。

1.3.7 Transwell檢測(cè) 取2×104細(xì)胞加入transwell板的上腔室。然后在底腔中加入100%完全的培養(yǎng)基。將基質(zhì)凝膠加入細(xì)胞中進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。24 h后，細(xì)胞用結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)。

1.3.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 取BALB/c裸鼠(5～6周齡)，將sh-NC和sh-LINC01006#1轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞懸浮在PBS中，然后注射到小鼠體內(nèi)。每5天測(cè)量腫瘤體積。1個(gè)月后，對(duì)小鼠實(shí)施安樂死。將小鼠體內(nèi)腫瘤切除并稱重。將轉(zhuǎn)染sh-NC和sh-LINC01006#1的DU145細(xì)胞注射到裸鼠尾靜脈進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。50 d后對(duì)小鼠實(shí)施安樂死。取肺后用濕甲醛溶液固定，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。最后在顯微鏡下觀察肺轉(zhuǎn)移灶。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)山東省濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬棗莊市立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 LINC01006對(duì)PCa細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲功能的影響 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析LINC01006表達(dá)水平(http://gepia.cancer-pku.cn/)，LINC01006在PCa組織和非癌組織中表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；以正常人前列腺上皮細(xì)胞系(RWPE-1)為對(duì)照，LINC01006在PCa細(xì)胞系(DU145、PC3、LNCAP和VCaP)中明顯表達(dá)上調(diào)(圖1)。敲除了PCa細(xì)胞中的LINC01006，通過細(xì)胞克隆增殖和EdU分析顯示，LINC01006沉默后細(xì)胞增殖顯著下降，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。TUNEL實(shí)驗(yàn)分析顯示，LINC01006下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖3)。transwell分析結(jié)果顯示，LINC01006缺陷后DU145和LNCAP細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低(圖4)。即LINC01006對(duì)PCa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲有明顯的促進(jìn)作用。

1A GEPIA數(shù)據(jù)庫分析LINC01006的表達(dá)水平 1B PCa細(xì)胞系中LINC01006表達(dá)水平(與RWPE-1比較，*P<0.05)圖1 GEPIA數(shù)據(jù)及PCa細(xì)胞系中LINC01006表達(dá)

3A TUNEL實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞凋亡視野 3B 轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡率(sh-NC與sh-LINC01006#1,sh-NC與sh-LINC01006#2比較，*P<0.05)圖3 TUNEL實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

4A 下調(diào)LINC01006,ytranswell分析遷移能力結(jié)果 4B 下調(diào)LINC01006,ytranswell分析侵襲能力結(jié)果(sh-NC與sh-LINC01006#1,sh-NC與sh-LINC01006#2比較，*P<0.05)圖4 transwell分析遷移和侵襲結(jié)果

2.2 LINC01006的海綿吸附作用 以starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)在CLIP數(shù)據(jù)>=1，Degradome數(shù)據(jù)>=0，泛癌>=6的條件下，篩選出3個(gè)miRNA(miR-148b-3p、miR-34a-5p和miR-6783-3p)，因miR-34a-5p是唯一顯示下調(diào)表達(dá)的miRNA，假設(shè)LIN01006是miR-34a-5p的海綿，圖5顯示了預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)。將miR-34a-5p模擬物轉(zhuǎn)染到PCa細(xì)胞中，顯示miR-34a-5p過度表達(dá)抑制了細(xì)胞增殖(圖6)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率提高(圖7)；transwell分析顯示miR-34a-5p模擬物降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖8)。即miR-34a-5p為L(zhǎng)INC01006海綿吸附作用位點(diǎn)，能減緩PCa的進(jìn)展。

圖5 star Base預(yù)測(cè)LIN01006與miR-34a-5p結(jié)合位點(diǎn)

6A 模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞克隆增殖視野 6B 細(xì)胞增殖結(jié)果比較(2組比較，*P<0.05)圖6 細(xì)胞克隆增殖結(jié)果

2.3 LINC01006基因?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響 將轉(zhuǎn)染sh-NC和sh-linc1006#1的DU145細(xì)胞注入6周齡裸鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，sh-LINC01006#1敲除組的腫瘤體積變小(圖9)。LINC01006被敲除后，腫瘤生長(zhǎng)速度變慢(圖10)。建立肺轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，sh-LINC01006#1組的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少(圖11)，LINC01006沉默后體內(nèi)轉(zhuǎn)移受到抑制。即通過敲除LINC01006，可以抑制動(dòng)物體內(nèi)PCa腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

7A miR-36a-5p上調(diào)后DU145細(xì)胞株凋亡率 7B miR-36a-5p上調(diào)后LNCAP細(xì)胞株凋亡率圖7 流式細(xì)胞檢測(cè)

8A miR-36a-5p上調(diào)后，transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 8B miR-36a-5p上調(diào)后，transwell分析侵襲能力(NC與miR-34a-5組比較，*P<0.05)圖8 transwell分析遷移和侵襲結(jié)果

圖9 2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤比較

圖10 2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)測(cè)量圖。(組間比較，*P<0.05)

2.4 LINC01006表達(dá)與術(shù)后病理和患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性 前列腺癌患者癌組織中LINC01006表達(dá)量水平為5.82±0.14，以≥5.50為L(zhǎng)INC01006高表達(dá)，<5.50為L(zhǎng)INC01006低表達(dá)，分析前列腺癌患者臨床參數(shù)與LINC01006表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。如表1所示，前列腺癌組織中LINC01006的表達(dá)水平與前列腺癌患者的年齡和腫瘤大小無關(guān)(P>0.05) ；與前列腺癌患者的術(shù)前PSA值、病理Gleason 評(píng)分及遠(yuǎn)處或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。

11A 轉(zhuǎn)染sh-NC組肺細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤(×200) 11B 轉(zhuǎn)染sh-linc1006#1組肺細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤(×200)(每視野計(jì)數(shù)比較，P<0.05)圖11 HE染色，肺轉(zhuǎn)移模型比較

表1 LINC01006表達(dá)與臨床資料的關(guān)聯(lián)性

續(xù)表1

3 討論

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，近幾年發(fā)病更有年輕化趨勢(shì)，危害男性健康。隨著疾病進(jìn)展會(huì)引發(fā)排尿障礙、疼痛、腎功能衰竭及尿潴留等癥狀,甚至轉(zhuǎn)移至骨骼、淋巴結(jié)及全身多器官。探索新的特異性分子生物標(biāo)志物及與前列腺癌增殖、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)前列腺癌診療有重要意義。lncRNAs異常表達(dá)影響癌癥的發(fā)病進(jìn)展，主要通過影響細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[11-12]。如，PCGEM1/miR-433-3p/FGF2信號(hào)通路異常導(dǎo)致腎癌細(xì)胞的惡性表型[13]，PVT1通過隔離miR-526b調(diào)節(jié)EZH2在非小細(xì)胞肺癌中作為腫瘤啟動(dòng)子發(fā)揮作用[14]，OIP5-AS1上調(diào)促進(jìn)胃癌發(fā)病進(jìn)展[15]。LINC01006在前列腺癌中的作用及機(jī)制的研究少有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)LINC01006沉默后細(xì)胞增殖顯著下降，細(xì)胞凋亡增加，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)敲除LINC01006基因抑制了前列腺癌細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移。而前列腺癌細(xì)胞中LINC01006表達(dá)上調(diào)促進(jìn)前列腺癌的發(fā)病進(jìn)展，以上結(jié)果表明LINC01006在前列腺癌發(fā)病中的作用。

研究表明，ceRNA網(wǎng)絡(luò)通路是lncRNAs潛在的致病機(jī)制，如lncRNA XIST通過介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[16]。張榮魁等[17]研究發(fā)現(xiàn)BCAR4通過作為miR-370-3p海綿激活Wnt信號(hào)通路加重膀胱癌進(jìn)展[18]。LINC01006作為miR-2682-5p的ceRNA增強(qiáng)HOXB8活性，從而促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展[18]。在本研究中，通過基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)LINC01006在前列腺癌中的靶作用點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p作為L(zhǎng)INC01006海綿化作用對(duì)象，抑制前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展，這與既往研究報(bào)道的miR-34a-5p阻止細(xì)胞遷移和侵襲結(jié)論相符[19]。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LINC01006在前列腺癌術(shù)后病理組織中呈高表達(dá)，表達(dá)水平與前列腺癌患者的年齡和腫瘤大小無關(guān)，與前列腺癌患者的術(shù)前PSA值、病理Gleason 評(píng)分和病灶轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。其表達(dá)水平與預(yù)后相關(guān)，呈現(xiàn)表達(dá)越高預(yù)后越差，可作為預(yù)后評(píng)判的分子標(biāo)志物。

綜上所述，LINC01006在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過調(diào)控miR-34a-5p表達(dá)，抑制前列腺癌的惡性程度進(jìn)度，降低復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率，從而為前列腺癌的早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。