彭中校，張華威，黃會，宮向紅，張秀珍*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺 264006)

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，除草劑已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的一類農(nóng)藥。由于大量的使用，除草劑不可避免地殘留于周圍環(huán)境如土壤、水體中，對環(huán)境、農(nóng)作物和非靶標生物造成一定的污染，對人體健康存在潛在的危害[1]。異丙甲草胺是一種酰胺類選擇性除草劑，其分子式為C15H22ClNO2，有4種光學(xué)異構(gòu)體，分別為aS,1S-、aR,1S-、aR,1R-和aS,1R-(圖1)。目前市面上常見的異丙甲草胺商品化產(chǎn)品有2種，一種為外消旋異丙甲草胺(Rac-metolachlor)，又稱都爾，另一種為富集了S對映體的S-異丙甲草胺(S-metolachlor)(圖2)，又稱精異丙甲草胺[2]。因異丙甲草胺具有廣譜、高效、選擇性強等特點，該農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于旱地作物、蔬菜作物、果園[3]和水稻移栽田等。異丙甲草胺可溶于水(在pH 7.3和25 ℃時溶解度為480 mg/L)，降解緩慢，在pH 1～9和25 ℃下半衰期超過200 d[4]，施藥后的活性持續(xù)時間較長，可達10～12周[5]。農(nóng)藥在田間使用后,只有少量停留在作物上發(fā)生效用,大部分則殘留在土壤或漂浮于大氣中,通過降雨、淋溶等途徑進入水體,從而污染水生生態(tài)環(huán)境的質(zhì)量,影響水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[6]。

圖1 異丙甲草胺的4種光學(xué)異構(gòu)體[2]Fig.1 Four optical isomers of metolachlor

圖2 異丙甲草胺的對映體結(jié)構(gòu)圖[8]Fig.2 Enantiomer structure diagram of metolachlor

異丙甲草胺作為除草劑已使用多時，海洋環(huán)境與海洋生物面臨著被其污染的風險，進而通過食物鏈影響人類健康，但國內(nèi)相關(guān)的環(huán)保法律法規(guī)尚未完善，因此異丙甲草胺成為一種新型污染物。近十年來，關(guān)于異丙甲草胺的生態(tài)風險以及對水產(chǎn)品質(zhì)量安全的影響成為一個研究熱點。除草劑脅迫對海洋生物的影響是多方面的。當生物體受到外源物脅迫時，機體為維持自身正常生長以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，而調(diào)整各種生理生化活動，包括生長、發(fā)育、繁殖以及各種生理活動都會發(fā)生變化，且這種變化會貫穿整個脅迫過程。當脅迫時間延長或外源物劑量增大時，生物體的這種自我調(diào)節(jié)能力便不能使機體保持穩(wěn)態(tài)，因此產(chǎn)生毒性效應(yīng)。本研究綜述了異丙甲草胺對水生動物與植物的毒性效應(yīng)，主要包括對水生生物急性毒性、生長發(fā)育毒性及生理毒性等，揭示異丙甲草胺污染對水產(chǎn)品質(zhì)量安全的影響，為分析異丙甲草胺污染對生態(tài)環(huán)境的健康風險評估、完善相關(guān)環(huán)境保護制度提供參考。

1 酰胺類除草劑概況

1.1 酰胺類除草劑的分類

在眾多除草劑中，酰胺類除草劑使用量較大，在全球農(nóng)藥市場排第9位，在除草劑中排第4位[9]。酰胺類除草劑根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理活性的不同，分為芳酰胺類和氯代乙酰胺類。氯代乙酰胺類除草劑主要包括甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺和異丙甲草胺等，用于芽前土壤處理，防除禾本科雜草[10-11]。

1.2 酰胺類除草劑污染、殘留狀況

除草劑的大量使用，已引起科研人員對除草劑在自然環(huán)境下的污染、殘留狀況的廣泛關(guān)注。國內(nèi)已有研究報道酰胺類除草劑在稻田、池塘等養(yǎng)殖環(huán)境中殘留情況，如在東北稻田養(yǎng)殖中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)樣品中檢出丁草胺和乙草胺[12];在哈爾濱市郊區(qū)的淡水養(yǎng)殖池塘的水體、底泥以及土壤中，乙草胺、丙草胺和丁草胺的檢出率為100 %[13]。國外的研究報道中，美國地質(zhì)調(diào)查局(USGS)[14]、瑞典[15]、印度[16]的學(xué)者也報道了當?shù)厮a(chǎn)品或者水體樣本的酰胺類除草劑檢出情況。關(guān)于酰胺類除草劑的環(huán)境行為研究表明，此類除草劑在自然界中的半衰期較長，如甲草胺在地表水的半衰期為808～1 518 d[17]，乙草胺和丁草胺的水解半衰期分別為2 310 d、1 155 d[18]。

1.3 酰胺類除草劑毒性概況

國內(nèi)外學(xué)者對酰胺類除草劑的大量使用而表現(xiàn)出來的毒害作用已有不少的研究。酰胺類除草劑對水生動物毒性主要表現(xiàn)為致畸、致死及影響酶活性等，對水生植物的毒性主要表現(xiàn)為降低植物細胞生物量、干擾細胞分裂等。斑馬魚(Brachydanioreriovar)經(jīng)苯酰草胺處理后，紅細胞微核細胞率明顯高于對照組[19]。金魚(Carassiusauratus)在濃度1.5 mL/L和2.0 mL/L的丁草胺中，血清過氧化物酶和酯酶活性降低或消失，酶活性與丁草胺濃度存在劑量-效應(yīng)關(guān)系[20]。低濃度的乙草胺和丁草胺對浮萍(Lemna)過氧化物酶活性表現(xiàn)為激活作用，高濃度時表現(xiàn)為抑制作用[21]。丁草胺不僅抑制青萍(Lemnaminor)生長，同時也損傷青萍葉片，降低其細胞葉綠素含量[22]。3.4 mg/L 丙草胺從原腸胚中期處理大鱗副泥鰍[Paramisgurnusdabryanus(Sauvage)]胚胎，其孵化率降至 48.40%，丙草胺對泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)幼魚的96 h半致死濃度(LC50)為0.401 97 mg/L，對大鱗副泥鰍幼魚的96 h LC50為0.326 50 mg/L[23]。另外，屬于同一類型的不同除草劑對于同一物種的毒性呈現(xiàn)出差異性，如對斑馬魚成魚，丁草胺屬極高毒類除草劑[24-25]，乙草胺、甲草胺、丙草胺以及異丙甲草胺屬中毒類除草劑[26]。同一種除草劑對映體則表現(xiàn)出選擇性差異，如S-異丙甲草胺和Rac-異丙甲草胺對斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)、普通核小球藻(Chlorellavulgaris)和水稻的毒性效應(yīng)表現(xiàn)出明顯差異性[2]。

由以上所述可知，酰胺類除草劑對水生生物的毒性效應(yīng)是多方面的，以下將從異丙甲草胺對水生生物的生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、基因表達和氧化應(yīng)激等方面進行綜述。

2 異丙甲草胺對水生生物的毒性效應(yīng)

2.1 異丙甲草胺對水生植物的毒性

2.1.1 急性毒性

與水生動物相比，水生植物在受到除草劑脅迫時其敏感性更強，因此研究異丙甲草胺對水生植物的急性毒性，進行毒性分級，為后續(xù)亞慢性和慢性毒性試驗提供線索，為相關(guān)環(huán)保措施的制定提供參考。Rac-及S-異丙甲草胺對斜生柵藻和普通核小球藻的96 h半數(shù)最大效應(yīng)濃度(EC50)分別為0.150、0.083 mg/L和0.383、0.170 mg/L[27]。異丙甲草胺作用72 h后，對四肩突四鞭藻(Bacillariophyceae)、布氏雙尾藻(Dinophyceae)和微小原甲藻(Chlorophyceae)的EC50分別為21.300、0.423和 0.070 mg/L[28]。異丙甲草胺對膨脹浮萍(Lemnagibba)和槐葉萍(Salvinianatans)的EC50分別為23、50 μg/L[29-30]。

2.1.2 生理毒性效應(yīng)

水生植物作為水體環(huán)境中的生產(chǎn)者，受到異丙甲草胺脅迫的來源與途徑都比較廣泛。研究異丙甲草胺對水生植物的影響，能較全面地認識異丙甲草胺對水體環(huán)境的污染現(xiàn)狀。異丙甲草胺對水生植物的生理毒性效應(yīng)主要包括對其生長、細胞分裂、光合色素含量以及抗氧化酶系的影響。杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)和抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)暴露于0.5～5.0 mg/L異丙甲草胺5 d，其生長抑制率達到9%，葉綠素含量的抑制率分別達到35%和25%，杜氏藻細胞密度抑制率更明顯，達到70%，兩種藻的細胞大小均增大，分別為1.20%和0.68%，細胞大小增大而細胞密度降低表明異丙甲草胺干擾藻類正常的細胞分裂[31]。附生硅藻暴露于5和30 μg/L的S-異丙甲草胺6 d后，葉綠素C和活細胞密度與對照組相比明顯降低，結(jié)果表明S-異丙甲草胺對附生硅藻細胞增殖的干擾大于對光合作用的干擾[32]。凱氏擬小球藻(Parachlorellakessleri)在2～200 μg/L的S-異丙甲草胺中暴露4至72 h后，結(jié)果表明即使在低于EC5010到20倍濃度的S-異丙甲草胺中，S-異丙甲草胺對凱氏擬小球藻的影響仍然明顯，其在藻類中產(chǎn)生活性氧，降低藻類的生長和光合色素的濃度，改變藻類的超微結(jié)構(gòu)和細胞的抗氧化能力[33]。Rac-異丙甲草胺和S-異丙甲草胺處理蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)后藻體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素含量降低，藻細胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離，葉綠體內(nèi)積累大量的淀粉粒，處于分裂狀態(tài)下的細胞數(shù)量增加，異丙甲草胺可能影響蛋白核小球藻的細胞分裂[34]。在異丙甲草胺中暴露96 h后，斜生柵藻細胞總可溶性蛋白含量與有毒物質(zhì)濃度呈負相關(guān)，斜生柵藻細胞超氧化物歧化酶(SOD)活性隨有毒物質(zhì)濃度的升高呈先激活后抑制的趨勢，對斜生柵藻細胞膜通透性的影響總體上呈正相關(guān)[35]。Rac-及S-異丙甲草胺對水稻種子、根系均有毒性作用，能抑制水稻根系活力，破壞根尖細胞結(jié)構(gòu)，抑制水稻根抗氧化酶系SOD、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活力，降低種子發(fā)芽率[36]。這些研究說明S-異丙甲草胺和Rac-異丙甲草胺均會破壞試驗植物的細胞結(jié)構(gòu)，抑制細胞生長和正常的代謝過程。

從上述可以得出，大多數(shù)關(guān)于異丙甲草胺對水生植物的毒性效應(yīng)的研究報道呈現(xiàn)出藥物劑量較高、作用時間短的特點。而異丙甲草胺在水體環(huán)境中，濃度一般較低，存在周期長，因此在往后的相關(guān)研究中可將異丙甲草胺對水生植物的慢性或亞慢性毒性作為一個研究重點。

2.2 對水生動物的毒性

2.2.1 急性毒性

水生動物作為食物鏈中比生產(chǎn)者高一級的消費者，研究異丙甲草胺對水生動物的急性毒性有助于初步評價其對人體產(chǎn)生損害的風險。斑馬魚胚胎在S-異丙甲草胺中暴露96 h，LC50為46.21 mg/L，發(fā)生畸變的EC50為29.40 mg/L[37]。太平洋牡蠣(Crassostreagigas)幼體在S-異丙甲草胺中暴露24 h，發(fā)生畸變的EC50為672 μg/L[38]。Rac-及S-異丙甲草胺對大型蚤(Daphniamagna)的LC50，24 h分別為69.4和51.2 mg/L[39]，根據(jù)毒性分級為低毒[40]。在24、48及72 h急性毒性實驗中，異丙甲草胺對中華大蟾蜍(Bufogargarizans)幼體的LC50分別為29.81、28.81和25.83 mg/L[41]。

2.2.2 發(fā)育毒性

國內(nèi)外關(guān)于異丙甲草胺對水生動物的毒性研究中，發(fā)育毒性是其中常見的研究指標，包括生長發(fā)育的影響、胚胎畸形、胚胎孵化率的影響等。太平洋牡蠣暴露在0.01 g/L的S-異丙甲草胺24 h后，其D型幼體畸形變異的百分率明顯增大，而且S-異丙甲草胺的胚胎毒性和基因毒性比其降解產(chǎn)物異丙甲草胺乙烷磺酸和異丙甲草胺草酸更強[42]。0.1 μg/L異丙甲草胺能明顯降低太平洋牡蠣精子的受精成功率和增加D型幼體畸形的發(fā)生率，從0.01 μg/L S-異丙甲草胺暴露的精子產(chǎn)生的后代，其發(fā)育發(fā)生變異的概率呈劑量依賴性增加[38]。異丙甲草胺及其降解產(chǎn)物異丙甲草胺草酸均會降低大理石紋螯蝦(Procambarusvirginalis)的生長率[43]，異丙甲草胺草酸在42和420 μg/L的濃度下會導(dǎo)致其個體發(fā)育顯著延遲[44]。S-異丙甲草胺的亞致死濃度會影響利比亞池蛙(Pelophylaxperezi)胚胎的正常發(fā)育，延遲孵化，縮短幼體的體長，并引起多種畸形，在較低濃度的測試中，幼體的長度也隨著S-異丙甲草胺濃度的增加而減少[45]。70.0 mg/L的S-異丙甲草胺對斑馬魚胚胎的孵化抑制率近乎達到100%，并引起胚胎發(fā)育的畸形[37]。太平洋牡蠣幼體暴露于S -異丙甲草胺后，發(fā)育停滯的百分比從100 ng/L顯著增加，而畸形的百分比僅在1 000 ng/L顯著增加[46]。胚胎和幼年時期是動物生長發(fā)育的重要敏感階段，該時期外源污染物的吸收和富集有可能導(dǎo)致胚胎、器官的發(fā)育不全，甚至引起死亡。因此，除草劑污染對水生動物發(fā)育生長的毒性效應(yīng)有可能成為影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全的一個重要因素，如漁獲量的降低，水產(chǎn)品肥滿度下降等都有可能與之有關(guān)。

2.2.3 生理代謝毒性

生理代謝作為生物體維持正常生命活動的一系列化學(xué)反應(yīng)的總稱，在毒物試驗中是一個研究熱點。通過研究受試生物生理代謝活動的變化，分析毒物的毒性作用機理。在異丙甲草胺對水生動物的生理代謝毒性的研究中，受試動物的抗氧化酶系活力以及與生長代謝有關(guān)的組織、器官是常見的研究指標與對象。異丙甲草胺草酸會降低大理石紋螯蝦超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶活性，降低谷胱甘肽水平和脂質(zhì)過氧化作用，并引起大理石紋螯蝦早期生活期間肝胰腺和鰓的病理變化[44]。暴露于S-異丙甲草胺與甲草胺草酸后，大理石紋螯蝦的血淋巴、肝胰腺和鰓的生化指標明顯不同于對照組，即使在28 d恢復(fù)期后，抗氧化生物標志物水平與對照組仍有明顯不同[47]。在濃度110 μg/L的S-異丙甲草胺下，大理石紋螯蝦的肝胰腺管系統(tǒng)包括焦解體管狀上皮和上皮細胞數(shù)量顯著減少,尤其是B細胞[44]。研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚在9.66 mg/L的S-異丙甲草胺中暴露96 h后，S-異丙甲草胺可誘導(dǎo)其體內(nèi)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(達256%)，抑制膽堿酯酶(達61%)和乳酸脫氫酶(達60%)，降低脂質(zhì)過氧化水平(達63%)[37]。當暴露于與環(huán)境濃度(1 μg/L)相當?shù)腟-異丙甲草胺及其降解物的混合物中時，斑馬魚中與甲狀腺代謝有關(guān)的基因會過度表達[48]。生活在異丙甲草胺濃度為119 ng/L水樣中的藻蝦(Palaemonetesintermedius)，檢測出其乙酰膽堿酯酶活性與對照組相比有明顯減低[49]。以上研究說明異丙甲草胺會干擾受試動物正常的生理代謝功能，對生物的酶系、細胞和組織等產(chǎn)生改變。現(xiàn)階段關(guān)于異丙甲草胺對水生動物生理代謝的毒性多集中于酶系的影響，缺乏關(guān)于藥物對生物體基因表達的影響，這一領(lǐng)域需要研究數(shù)據(jù)的補充。

2.2.4 其他毒性

異丙甲草胺的其他毒性主要是對水生動物行為狀態(tài)的改變，進而影響其生存和繁殖狀態(tài)。當太平洋牡蠣D型幼體暴露在環(huán)境濃度的S-異丙甲草胺中時，雖然最大移動速度和平均移動速度無明顯變化，但移動路徑中為圓形的概率會顯著增大。目前的研究表明，直線型軌跡與正常幼體呈正相關(guān)，而貝殼異常幼體與圓形軌跡呈正相關(guān)。這種不正常的行為會影響幼體的生存和繁殖，從而影響新棲息地的形成和定殖[46]。高劑量亞致死濃度的異丙甲草胺可能會影響小龍蝦(Procambarusclarkii)接收和回復(fù)群體信號的能力，進而影響并減弱小龍蝦的競爭行為和攻擊性[50]。目前關(guān)于異丙甲草胺對水生動物日常生命活動的影響研究較少，如魚類、甲殼類動物的攝食行為、貝類的攝食和濾水行為等，這些數(shù)據(jù)能直觀地反映異丙甲草胺對生物體生存狀態(tài)的改變。

綜上所述，有關(guān)異丙甲草胺對水生動物毒性效應(yīng)的研究報道中，實驗對象種類較多，涉及生理學(xué)、組織病理學(xué)、酶學(xué)和分子生物學(xué)等角度，但與水生植物的相關(guān)研究一樣，低劑量藥物暴露下亞慢性及慢性毒性的相關(guān)數(shù)據(jù)較少。另外，異丙甲草胺對映體的毒性差異也是一個有待突破的研究方向。

3 展望

異丙甲草胺作為一種重要的除草劑，于1978年實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，至今已有較長的使用時間。近幾年隨著環(huán)保要求的提高，歐洲部分國家和地區(qū)已逐步禁止使用異丙甲草胺，轉(zhuǎn)為使用其活性體精異丙甲草胺[51]，精異丙甲草胺除草活性更高，因而減少了施用量以及異構(gòu)體的種類。但鑒于異丙甲草胺的難降解性以及在大部分國家中仍然使用的現(xiàn)狀，同時異丙甲草胺降解產(chǎn)物異丙甲草胺乙烷磺酸(MESA)和異丙甲草胺草酸(MOA)被確定為地下水中存在的農(nóng)藥衍生化合物[52]，異丙甲草胺及其相關(guān)產(chǎn)物在未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中仍會產(chǎn)生相當大的影響，并成為新型污染物，關(guān)于異丙甲草胺對水生生物的毒性效應(yīng)以及對水產(chǎn)品質(zhì)量安全的影響具有更加深入的研究意義。

現(xiàn)今大多數(shù)關(guān)于除草劑污染的毒理學(xué)研究，通常集中于高劑量暴露的影響上，但現(xiàn)實中水體農(nóng)藥濃度一般處于低濃度，為了解除草劑污染對自然環(huán)境和生物的影響，未來的研究應(yīng)將重點集中于除草劑在慢性、低劑量的暴露水平下，對環(huán)境和生物的影響上。

另外，異丙甲草胺的毒性效應(yīng)并不是單獨發(fā)生的，可能具有與其他因素聯(lián)合作用的影響，如溫度、氣候[53]、農(nóng)藥混合物[49,54-55]、重金屬[56]、天然溶解的有機物[57]以及異丙甲草胺的降解產(chǎn)物MESA、MOA。MESA、MOA更穩(wěn)定，流動性更強[43]，可以在土壤中維持3年或更長時間，其出現(xiàn)頻率通常是母體的3～45倍。有研究表明這兩種降解產(chǎn)物對水生物種形成威脅，毒性機制與異丙甲草胺不同[42,47]，在基因表達水平上，降解物的影響比母體更強[48]，但降解物的毒性機理仍需深入研究。藻類是水生生物的基本組成部分，受農(nóng)藥污染比較嚴重，有研究表明被農(nóng)藥污染后受損的藻類細胞仍能分裂[33]，這可能是一個潛在的環(huán)境毒性因素，會進一步影響食物鏈中的高等生物。因此研究異丙甲草胺在水生生物中的富集作用以及在食物鏈中的傳遞也是值得關(guān)注的研究方向，這可更全面的反映異丙甲草胺的污染狀況，為完善相關(guān)的環(huán)保監(jiān)督機制提供技術(shù)支撐。

今后對異丙甲草胺的研究可以從以下三方面深入：一是驗證異丙甲草胺對生化和基因組水平的影響；二是分析降解產(chǎn)物對生物體產(chǎn)生毒性影響的作用機理；三是綜合考慮其他因素，包括物理、化學(xué)的影響因素和環(huán)境、氣候因素，綜合評價其毒性效應(yīng)。綜合考慮異丙甲草胺單獨以及與各種因素的聯(lián)合效應(yīng)，才能更準確地評估其生態(tài)風險性，提高其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)使用中的合理性，降低其對環(huán)境、生物和人類的潛在風險。