李旭東，艾曉輝，劉永濤，童桂香，韋信賢*，楊移斌*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2.河南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南 鄭州 450008；3.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，俗稱(chēng)小龍蝦，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱、十足目、螯蝦科、原螯蝦屬(Procambarus)，原產(chǎn)于北美洲[1]。1930年經(jīng)日本引進(jìn)到中國(guó)進(jìn)行養(yǎng)殖，因其食性雜、生長(zhǎng)速度快、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，并且肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)成分豐富等因素，使得克氏原螯蝦消費(fèi)量呈現(xiàn)暴發(fā)式增長(zhǎng)[2]。

據(jù)《中國(guó)小龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告(2019)》[3]顯示，2007—2018年，小龍蝦產(chǎn)量由26.55萬(wàn)t激增至163.87萬(wàn)t，增長(zhǎng)率達(dá)517.21%，僅2018年與2017年相比，小龍蝦總產(chǎn)量增長(zhǎng)45.07%。2018 年中國(guó)小龍蝦全社會(huì)經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值3 690億元，同比增長(zhǎng)37.50%。以上數(shù)據(jù)表明小龍蝦正成為養(yǎng)殖戶(hù)重要經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源。

隨著人們對(duì)小龍蝦消費(fèi)需求的日益增長(zhǎng)，其養(yǎng)殖面積及規(guī)模不斷擴(kuò)大，致使小龍蝦養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化小龍蝦病害頻發(fā)。目前國(guó)內(nèi)報(bào)道引起小龍蝦死亡的病原有很多，包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等，這些疾病的暴發(fā)給快速發(fā)展的小龍蝦產(chǎn)業(yè)蒙上了一層陰影[4-6]。

近年來(lái)，在5月份的小龍蝦疾病多發(fā)，且死亡率高，養(yǎng)殖戶(hù)稱(chēng)此階段為小龍蝦“五月瘟”。為了解決實(shí)際生產(chǎn)問(wèn)題，本研究深入湖北的多個(gè)小龍蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)，對(duì)養(yǎng)殖戶(hù)口中的“五月瘟”疾病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，并取樣進(jìn)行分析，為小龍蝦“五月瘟”的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

患病克氏原螯蝦采自湖北荊州、孝感、咸寧、荊門(mén)及黃岡等地養(yǎng)殖場(chǎng)。健康克氏原螯蝦購(gòu)自武漢白沙洲水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，體重(20±2)g，健康無(wú)傷病，活力強(qiáng)，暫養(yǎng)7 d無(wú)異常后用于試驗(yàn)。

1.1.2 試劑

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂及肉湯、MH瓊脂、藥敏紙片及細(xì)菌生化微量鑒定管均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；PCR 所用試劑、特異性引物及細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查及臨床診斷

對(duì)患“五月瘟”的克氏原螯蝦主要癥狀、發(fā)病時(shí)養(yǎng)殖及周邊環(huán)境以及危害對(duì)象、程度及規(guī)模進(jìn)行調(diào)查，了解用藥史及采取的防控措施等情況，并進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)解剖診斷觀察。

1.2.2 細(xì)菌分離純化

取每批瀕死并具有典型癥狀的克氏原螯蝦10只，體表經(jīng)75%酒精擦拭后于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)解剖，取其肝胰腺，利用無(wú)菌接種環(huán)取肝胰腺少許組織劃線(xiàn)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)大小相近、顏色一致的菌落平板進(jìn)一步純化培養(yǎng)。將分離純化得到的菌株與30%甘油混合均勻，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 回歸感染

根據(jù)Koch法則及鑒定結(jié)果[7]，選擇2株(分別編號(hào)為：XX01和XX02)細(xì)菌進(jìn)行回歸感染試驗(yàn)以檢測(cè)其致病性。將分離株在28 ℃的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，在4 ℃下4 000 r/min離心5 min收集菌體，然后用無(wú)菌PBS緩沖液重新懸浮，將細(xì)菌懸液濃度調(diào)整至試驗(yàn)所需濃度4 ℃放置備用。

將600只健康克氏原螯蝦隨機(jī)分為6組，即實(shí)驗(yàn)組A、B、C、D和E組，對(duì)照組F組，每組100只克氏原螯蝦。其中A組和B組，每只克氏原螯蝦注射0.1 mL的XX01菌液，每只劑量分別為103、106CFU；C組和D組，每只克氏原螯蝦注射0.1 mL的XX02菌液，每只劑量分別為103、106CFU；E組每只克氏原螯蝦注射0.1 mL的XX01與XX02 1∶1(V∶V)混合菌液，每只注射混合菌液總劑量為106CFU；對(duì)照組F，每只克氏原螯蝦注射相同劑量的無(wú)菌PBS。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，溶解氧保持在7.5～8.5 mg/mL，水溫為24～26 ℃，用完全曝氣的自來(lái)水進(jìn)行養(yǎng)殖，感染實(shí)驗(yàn)周期為7 d。每天記錄臨床癥狀和死亡率。同時(shí)對(duì)死亡的克氏原螯蝦進(jìn)行解剖，并進(jìn)行細(xì)菌分離純化及鑒定。

1.2.4 分子鑒定

將分離菌株接種于腦心浸出液，置于搖床恒溫28 ℃培養(yǎng)24 h，菌液經(jīng)高速離心后收集菌體，提取DNA作為PCR擴(kuò)增模板。細(xì)菌16S rRNA序列擴(kuò)增通用引物為27F：5'-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。參照王小亮等[8]方法進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增產(chǎn)物確定為目的片段后送上海生工進(jìn)行純化及序列測(cè)定。

將分離株16S rDNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果下載同源性較高的序列，采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列匹配分析，通過(guò)MEGA5.1 軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，1 000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

1.2.5 生化鑒定

將分離菌株劃線(xiàn)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上于28 ℃培養(yǎng)24 h后，挑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，參照文獻(xiàn)[9]測(cè)定，使用微量生化反應(yīng)管測(cè)定分離菌株主要的理化指標(biāo)。

1.2.6 藥敏特性分析

分離株XX01及XX02的藥敏特性分析參照NC-CLS抗微生物藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)采用K-B法進(jìn)行[10]。將分離株XX01及XX02接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，28 ℃恒溫震蕩(200 r/min)培養(yǎng)24 h，用PBS稀釋成濃度為107CFU/mL的菌懸液，取100 μL菌液涂布于MH瓊脂上，在平板表面貼上選擇好的藥敏紙片，將平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈大小。參照杭州微生物公司藥敏紙片說(shuō)明書(shū)進(jìn)行敏感度判定。

1.2.7 治療研究

根據(jù)分離株藥敏特性研究結(jié)果，選擇對(duì)二者高度敏感且允許使用的藥物進(jìn)行臨床治療實(shí)驗(yàn)。選擇自然發(fā)病的克氏原螯蝦養(yǎng)殖池A、B、C和D，使用所選定的藥物進(jìn)行治療研究。A池使用選定藥物加黃芪多糖(質(zhì)量比為1∶1，20 mg/kg蝦體重)、B池僅使用選定藥物(20 mg/kg蝦體重)、C池僅使用黃芪多糖(20 mg/kg蝦體重)及D組對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保證水質(zhì)指標(biāo)均符合漁業(yè)用水標(biāo)準(zhǔn)(GB 11607— 1989)，并將死亡克氏原螯蝦及時(shí)撈出。每天記錄克氏原螯蝦臨床表現(xiàn)、癥狀及死亡率。

2 結(jié)果

2.1 病原確定

調(diào)查發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦“五月瘟”發(fā)病周期較長(zhǎng)，一般為每年3～7月，發(fā)病高峰期主要集中在5月，發(fā)病水溫一般為25～30 ℃，發(fā)病死亡率高，治療難度大，而此時(shí)也正好是克氏原螯蝦大規(guī)模上市及二次投苗的時(shí)間，給養(yǎng)殖戶(hù)造成的經(jīng)濟(jì)損失很大。發(fā)病克氏原螯蝦主要癥狀表現(xiàn)為活力低下、有肌無(wú)力癥、反應(yīng)遲鈍，解剖后發(fā)現(xiàn)腸道及肝胰腺有出血點(diǎn)、鰓部發(fā)黑等癥狀。湖北各地克氏原螯蝦主養(yǎng)區(qū)均有暴發(fā)。

實(shí)驗(yàn)共取樣137份帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)等感染。細(xì)菌分離純化到的菌株2種，編號(hào)為XX01及XX02，其中僅檢出XX01的樣本占25.54%，僅檢出XX02占12.42%，二者均檢出的占62.04%。

經(jīng)回歸感染試驗(yàn)，結(jié)果顯示XX01株在106CFU/只克氏原螯蝦劑量下，克氏原螯蝦全部死亡，而103CFU/只克氏原螯蝦劑量下，克氏原螯蝦發(fā)病率、死亡率均不高；而XX02分離株在106CFU/只克氏原螯蝦劑量時(shí)7 d內(nèi)死亡率僅31%，在103CFU/只克氏原螯蝦劑量下幾乎無(wú)死亡；XX01與XX02分離株1∶1混合后以106CFU/只劑量感染克氏原螯蝦，引起的死亡率與XX01單獨(dú)106CFU/只劑量感染克氏原螯蝦一致，但死亡速率更快；對(duì)照組F組未出現(xiàn)異常。分別從試驗(yàn)組死亡的克氏原螯蝦體內(nèi)分離到與注射菌株形態(tài)特征及理化特性一致的菌株。

2.2 細(xì)菌鑒定

對(duì)分離株的16S rDNA基因序列與NCBI中已有序列比對(duì)，顯示分離株XX01與氣單胞菌屬種類(lèi)同源性最高，而分離株XX02與檸檬酸桿菌屬種類(lèi)同源性最高，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，菌株XX01與嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)聚為一支，菌株XX02與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)聚為一支。分離株的主要理化特性見(jiàn)表1～2，顯示菌株XX01理化特性與嗜水氣單胞菌一致，菌株XX02理化特性與弗氏檸檬酸桿菌一致。結(jié)合分離株主要理化特性測(cè)定結(jié)果，綜合判定XX01為嗜水氣單胞菌，XX02為弗氏檸檬酸桿菌。

圖1 回歸感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Regression infection test results

圖2 基于16S rRNA構(gòu)建的關(guān)于XX01 和 XX02的進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree for 16S rRNA sequence of XX01 and XX02

表1 菌株XX01的生化特性Tab.1 Physiologic and biochemical characteristics of XX01 bacterial strain

2.3 藥敏特性

研究測(cè)定了分離株XX01及XX02對(duì)8類(lèi)19種抗生素的敏感性。結(jié)果表明兩種分離株對(duì)新霉素、阿奇霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、依諾沙星、諾氟沙星、氯霉素及氟苯尼考等8種抗生素高度敏感，其中氟苯尼考、強(qiáng)力霉素及新霉素在水產(chǎn)上允許使用，具體見(jiàn)表3。

表2 菌株XX02的生化特性Table 2 Physiologic and biochemical characteristics of XX02 bacterial strain

表3 菌株XX01及XX02的藥敏特性Table 3 Susceptibility of XX01 and XX02 to antibiotics

根據(jù)分離株藥敏特性結(jié)果，選擇氟苯尼考搭配黃芪多糖作為治療藥物。研究發(fā)現(xiàn)A組治愈率最高，一個(gè)療程內(nèi)死亡率明顯下降；B組與對(duì)照組死亡率接近；C組死亡率首先急劇下降，克氏原螯蝦活力增強(qiáng)，第5天左右死亡率出現(xiàn)反彈，治療效果一般。

3 討論

本研究經(jīng)廣泛調(diào)查取樣，基本確定了克氏原螯蝦“五月瘟”典型癥狀。從所取137份樣品中分離到2株優(yōu)勢(shì)菌，二者混合感染率在62.04%。之所以會(huì)出現(xiàn)僅分離到單株優(yōu)勢(shì)菌的情況，本研究認(rèn)為可能是取樣劃線(xiàn)的誤差以及感染菌量等導(dǎo)致的，實(shí)際很可能是所有樣品中都存在兩種菌株感染。經(jīng)回歸感染發(fā)現(xiàn)，分離株均可導(dǎo)致克氏原螯蝦發(fā)病死亡，與以往研究結(jié)果一致[11-12]，并能從發(fā)病死亡個(gè)體上再分離到感染菌株。研究結(jié)果在一定程度可證實(shí)此次分離株對(duì)克氏原螯蝦存在毒性，是克氏原螯蝦“五月瘟”的重要病原，而嗜水氣單胞菌是主要致死菌株。本研究也證明了“五月瘟”可能是多病原多重感染導(dǎo)致的，這與唐慶權(quán)[13]等研究結(jié)果一致。從回歸感染結(jié)果看，單獨(dú)的分離株XX02致病能力并不強(qiáng)，而低濃度XX01致病能力也不強(qiáng)，但二者1∶1混合后，毒力明顯增強(qiáng)，推測(cè)二者之間可能存在協(xié)同作用。

目前水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控仍然以化藥為主，抗生素是其中重要代表[14]。但是因抗生素大量無(wú)序、盲目使用，常導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物病原菌耐藥株出現(xiàn)，給水產(chǎn)動(dòng)物病害治療帶來(lái)了極大的麻煩。因此為達(dá)到精準(zhǔn)用藥的目的，必須準(zhǔn)確診斷，確定病原病因，并根據(jù)病原的藥物敏感特性有針對(duì)性地選擇藥物。

本研究結(jié)果表明兩種分離株均對(duì)氟苯尼考、新霉素、阿奇霉素及四環(huán)素等8種抗生素高度敏感。因此本研究使用分離株共同敏感的藥物氟苯尼考進(jìn)行治療研究，配合黃芪多糖共同使用取得了很好的療效。治療方案的制定做到了疾病準(zhǔn)確診斷，根據(jù)病原藥敏特性選擇相應(yīng)藥物可以達(dá)到高效治療疾病的目的。在研究治療效果時(shí)，配合黃芪多糖使用，則是因?yàn)辄S芪多糖具有一定的排毒增強(qiáng)免疫的效果[15]。在實(shí)際水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病治療過(guò)程中，通常會(huì)在治療中后期出現(xiàn)一個(gè)死亡高峰，主要原因是水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病多為革蘭氏陰性菌，其死亡后會(huì)釋放大量的內(nèi)毒素，導(dǎo)致病魚(yú)加速死亡，此次治療研究添加黃芪多糖就是解決此關(guān)鍵問(wèn)題，這項(xiàng)成果已經(jīng)得到廣大一線(xiàn)魚(yú)病技術(shù)人員的認(rèn)可。細(xì)菌的耐藥性不同，其可能原因在于養(yǎng)殖環(huán)境、地域及用藥差異等造成的[16]。為此在水生動(dòng)物病害防控時(shí)，有必要每次都測(cè)定其藥物敏感特性，選擇高度敏感而且允許使用的藥物，按照商品藥物說(shuō)明書(shū)并在獸醫(yī)師指導(dǎo)下使用。