汪倩，宋超，劉照關(guān)，裘麗萍，吳偉，胡庚東，孟順龍,3，陳家長,3*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無錫214081；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(無錫)，江蘇 無錫214081；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141；4.蘇州為度生物技術(shù)有限公司，江蘇 蘇州 215000)

近年來，中國經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展的同時，能源、資源大量消耗，許多含汞的污染物質(zhì)隨著生態(tài)系統(tǒng)的自然運(yùn)轉(zhuǎn)進(jìn)入水體，目前在某些地區(qū)的水體中仍可檢測到較高濃度的汞[1-3]。由于汞的高毒性[4-5]，在《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)[6]中，對其限量值做了嚴(yán)格規(guī)定，其中Ⅰ類和Ⅱ類水標(biāo)準(zhǔn)限制為0.05 μg/L，主要應(yīng)用于農(nóng)業(yè)用水的Ⅴ類地表水標(biāo)準(zhǔn)為1.00 μg/L；在《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607—1989)[7]中，對中國漁業(yè)水質(zhì)中的汞含量做了明確的限制，不得超過0.50 μg/L。目前，有學(xué)者曾對環(huán)太湖流域及湖體本身的重金屬污染進(jìn)行了研究。徐澤新等[8]對太湖流域湖蕩濕地的表層沉積物中汞的空間分布研究發(fā)現(xiàn)，汞在常州地區(qū)為輕度污染，在無錫、湖州、蘇州及宜興地區(qū)為偏中度污染。焦偉等[9]發(fā)現(xiàn)環(huán)太湖進(jìn)出口河流的水體受到了不同程度的重金屬污染。張小林等[10]和Wang等[11]通過對中國渤海海水進(jìn)行污染調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其受一定程度的汞污染。王乃姍等[12]發(fā)現(xiàn)河北衡水湖濕地表層水中總汞含量最高達(dá)0.57 μg/L，處于低生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)區(qū)。張少慶等[13]研究葫蘆島市區(qū)不同的3條河流水體中汞的污染情況，發(fā)現(xiàn)五里河水中總汞濃度達(dá)10.45 μg/L，茨山河水中總汞濃度達(dá)11.04 μg/L，連山河區(qū)域由于降水沖刷帶入河流造成的總汞濃度達(dá)17.32 μg/L。同時，也有許多學(xué)者[14-17]發(fā)現(xiàn)中國部分水庫以及某些河流均受到了嚴(yán)重的汞污染。汞作為環(huán)境中一種生物毒性極強(qiáng)的持久性重金屬污染物的辦法，進(jìn)入生物體后很難被排出，由于生物濃縮和生物放大效應(yīng)，水體汞污染對人類健康造成了嚴(yán)重威脅。2013年，包括中國在內(nèi)的87個國家和地區(qū)共同簽署了《關(guān)于汞的水俁公約》[18]，以尋求全球攜手減少汞污染的辦法，該公約在2017年8月16日生效，條例明令各國從2020年起，禁止生產(chǎn)及進(jìn)出口含有水銀的制品。因此，在水環(huán)境治理領(lǐng)域，對于水中汞污染的吸附去除技術(shù)研究越來越受到大家的關(guān)注。

有研究學(xué)者[19-22]提出的常被用來處理國內(nèi)水污染中重金屬吸附去除的方法主要包括植物修復(fù)技術(shù)以及基因工程等現(xiàn)代生物技術(shù)，而國外研究較多的主要是利用生物包括發(fā)酵工業(yè)的菌絲體廢渣或海洋微生物對重金屬的吸附作用，來治理重金屬造成的污染。而在水體汞污染治理領(lǐng)域，Amde等[23]提出了運(yùn)用改性后的納米棒材料去除水體中游離的二價(jià)汞，在真實(shí)樣品的應(yīng)用去除過程中，對汞含量在 0.01 ～10.00 mg/L的水體樣本有較好的去除效果。Shukla等[24]運(yùn)用噴霧干燥法合成一種納米二氧化硅-釀酒酵母生物雜交材料去除汞，在溶液pH 6.50和溫度24.85 ℃時具有較好的吸附效果。張慧聰?shù)萚25]采用在NH3氣氛下用氯等離子體改性生物炭進(jìn)行除汞，其除汞效率達(dá)17.50%。有學(xué)者[26-29]運(yùn)用葡萄蔗渣等廢料進(jìn)行汞吸附劑的研究，或者使用改性后的活性炭作為低成本吸附劑研究從水溶液中吸附汞，以及運(yùn)用蘇云金芽孢桿菌MC28作水處理過程中的吸附劑?，F(xiàn)有汞污染治理研究的方法中，由于操作工藝復(fù)雜、處理過程中對環(huán)境要求高且處理效果還有待進(jìn)一步提高等特點(diǎn)，不利于推廣及運(yùn)用，因此開發(fā)出高效、實(shí)用的汞分離檢測新材料以解決水環(huán)境中汞污染問題，顯得尤為重要。

針對目前國內(nèi)外研究方法存在不足這一情況，本實(shí)驗(yàn)擬采用經(jīng)羧基官能團(tuán)修飾后的超順磁磁性微球，通過化學(xué)鍵合或者物理吸附的方法將能與汞元素結(jié)合的胸腺嘧啶核苷酸作為抗體固載到磁性微球表面，從而特異性捕獲水環(huán)境中存在的汞元素，運(yùn)用磁性分離的方法實(shí)現(xiàn)水環(huán)境中汞的特異性吸附去除，達(dá)到操作簡便且高效去除汞的目的，為中國水環(huán)境汞污染治理研究提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Hydra AA系列全自動測汞儀(上海沃瓏儀器有限公司)；Agilent 7800 ICP-MS(美國安捷倫科技有限公司)；Master-QUT水純化系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)；超順磁磁性微球(蘇州為度生物技術(shù)有限公司)；10.0 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(美國安捷倫科技有限公司)；100.0 mg/L 內(nèi)標(biāo)溶液(美國安捷倫科技有限公司)；1.0 μg/L 質(zhì)譜調(diào)諧液(美國安捷倫科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)過程中所用各種酸及試劑均為優(yōu)級純；所有玻璃器皿均用5%硝酸浸泡過夜并用純水沖洗干凈備用；實(shí)驗(yàn)室用水均由超純水機(jī)提供。

1.2 超順磁磁性微球的羧基化

在70 ℃水體環(huán)境中加入表面活性劑與羧基基團(tuán)活化劑，運(yùn)用聚合反應(yīng)，對磁性裸珠微球進(jìn)行羧基修飾過程，即在磁性微球的表面引入羧基(—COOH)官能團(tuán)，形成穩(wěn)定羧基微球。

1.3 胸腺嘧啶偶聯(lián)羧基化磁性微球

1.3.1 微球的清洗

使用前將微球混勻，取100 μL的微球到一個新的2 mL離心管中，然后加入200 μL 50 mmol/L MES(pH 6.0)混勻，離心去除上清液(離心轉(zhuǎn)速為20 000 r/min，時間為20 min)，最終將微球超聲重懸于500 μL MES緩沖液中。

1.3.2 微球的活化

往離心管中分別加入使用50 mmol/L MES(pH 6.0)新鮮配制的20 μL NHS(50 mg/mL)和EDC(50 mg/mL)反應(yīng)液，旋渦振蕩混勻使微球充分懸浮，置于混合器上室溫旋轉(zhuǎn)孵育15 min。

1.3.3 微球與胸腺嘧啶的偶聯(lián)

孵育結(jié)束后用500 μL MES緩沖液清洗2次，去除上清，往微球中加入500 μL胸腺嘧啶核苷酸，旋渦振蕩混勻使微球均勻后室溫孵育2～4 h。

1.3.4 微球上未結(jié)合表面基團(tuán)的封閉

反應(yīng)完成后離心去除上清液，然后往離心管中加入500 μL的封閉液(2% BSA，100 mmol/L乙醇胺溶液，pH 8.0)進(jìn)行封閉，室溫孵育2 h。

1.3.5 偶聯(lián)完成后微球的清洗與保存

將偶聯(lián)后的微球用1 mL封閉液進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌2次，然后將微球重新懸浮于500 μL PBS緩沖液(50 mmol/L PBS，pH 7.4)或Tris緩沖液(50 mmol/L Tris，pH 8.0)中，置于4 ℃保存。

1.4 胸腺嘧啶偶聯(lián)羧基化磁性微球材料的表征

采用透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡對本次實(shí)驗(yàn)制備的羧基微球偶聯(lián)一定長度胸腺嘧啶的新型磁珠材料進(jìn)行了表面微觀結(jié)構(gòu)的表征(圖1和圖2)，通過觀察其微觀結(jié)構(gòu)，不難發(fā)現(xiàn)新型磁珠材料具有良好的分散性，呈圓球狀，形貌清晰。

圖1 材料透射電鏡圖Fig.1 TEM image of the material

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.5.1 汞標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將10.0 mg/L汞單標(biāo)儲備液用2%硝酸稀釋為100.0 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)中間液，由標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作系列，濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L，汞溶液均現(xiàn)配現(xiàn)用，將測汞儀的各項(xiàng)參數(shù)調(diào)試到最佳狀態(tài)，待儀器穩(wěn)定后，測定標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)際濃度，每個樣采集3次數(shù)據(jù)，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.999(圖3)。

圖3 汞標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Mercury standard curve

1.5.2 混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將10.0 mg/L混標(biāo)(Cr、Mn、Ni、Cu、Cd、Pb、As、Se和Ag)儲備液用2%硝酸作溶劑稀釋為100.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，由標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作系列，濃度分別為0、1.0、5.0、10.0、25.0和50.0 μg/L，運(yùn)用ICP-MS儀器，編輯批處理方法，待儀器調(diào)諧穩(wěn)定后，測定混標(biāo)實(shí)際濃度，要求混標(biāo)中各重金屬元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.999，對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)RSD小于5%。

表1 回歸方程與檢出限Tab.1 Regression equation and detection limit

1.6 樣品中汞的固定

由于汞的強(qiáng)吸附效應(yīng)和不穩(wěn)定性，給汞的測定帶來一定困難，研究者[30-31]在對汞進(jìn)行分析測驗(yàn)過程中，為了確保樣品分析檢測的準(zhǔn)確性，會對采集的水樣進(jìn)行汞的固定，固定方法一般是采用2%硝酸或者低濃度的鹽酸進(jìn)行樣品的酸化，以抑制汞的流失。

本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步研究溶液pH及盛裝樣品的容器材質(zhì)對汞揮發(fā)的影響，通過采用體積相同的塑料與玻璃兩種材質(zhì)的容器盛裝由幾種不同的溶劑作為介質(zhì)配制的3種pH條件(酸性、中性及堿性)下濃度為10 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)汞液250 mL，實(shí)驗(yàn)編號依次為A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E1、E2、F1和F2，各編號對應(yīng)的溶劑、容器及具體的pH如表2所示，汞的初始母液濃度均為10 mg/L溶于2%硝酸，稀釋方式均保持一致。運(yùn)用測汞儀分別測定室溫狀態(tài)下靜置時間為0、24及48 h的樣品中汞濃度，比較不同介質(zhì)中汞的揮發(fā)性強(qiáng)弱，優(yōu)選出可以使汞穩(wěn)定存在的介質(zhì)環(huán)境，以利于后續(xù)準(zhǔn)確分析磁珠材料對汞的吸附效果。

表2 各實(shí)驗(yàn)編號對應(yīng)表Tab.2 Correspondence table for each experiment number

由圖4可知，實(shí)驗(yàn)編號為D1、D2、E1、E2、F1和F2的樣品中，溶液初始的汞濃度(即靜置時間為0對應(yīng)的濃度)與配制的理論濃度10 μg/L相差甚遠(yuǎn)，說明在堿性或中性環(huán)境中，用同一母液采用同樣的稀釋方式配制10 μg/L汞液時，汞揮發(fā)性較明顯；同時也說明，用超純水作為溶劑直接稀釋母液，汞極易揮發(fā)。實(shí)驗(yàn)編號為A2、B1、B2、C1及C2的樣品中，溶液初始的汞濃度測定值與配制的理論濃度10 μg/L相近，說明在酸性環(huán)境中，能較好地抑制汞的揮發(fā)，而盛裝溶液的材質(zhì)對汞揮發(fā)性影響不大，這與Takeuchi等[32]的研究結(jié)果相一致。因此，為便于操作以及節(jié)約成本，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中采用2%硝酸對樣品溶液中汞進(jìn)行固定，運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的塑料容器盛裝樣品。

圖4 汞揮發(fā)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果對照圖Fig.4 Comparison chart of mercury volatility experiment results

1.7 汞的測定與檢測限

實(shí)驗(yàn)過程中，基于元素汞在室溫，不加熱條件下，即能揮發(fā)成汞蒸氣并對波長253.7 mm的紫外光具有強(qiáng)烈的吸收作用，在一定濃度范圍內(nèi)汞濃度與吸收值成正比。將水樣經(jīng)某種處理后，加氯化亞錫，把水樣中的汞離子還原成元素汞，用載氣將汞蒸氣帶入吸收池內(nèi)，用光電管檢測吸收池內(nèi)紫外線強(qiáng)弱變化，產(chǎn)生的光電信號經(jīng)轉(zhuǎn)換，放大及信號處理輸出到數(shù)字顯示表或記錄儀上，從而實(shí)現(xiàn)對樣品中汞含量的分析和測試。

由于實(shí)驗(yàn)水體中汞含量均較低，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，通過逐級稀釋法分析測試得出儀器檢測限：0.050 μg/L，定量限：0.112 μg/L。

1.8 吸附和去除實(shí)驗(yàn)

在磁珠材料粒徑優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用2% HNO3作為溶劑配制10 μg/L汞液，取12個1.5 mL的塑料離心管，編號1～12，用移液槍依次取該汞液1 mL至編號后的12個塑料離心管中，投入由粒徑依次為3、1及0.6 μm的裸珠合成的3種不同粒徑新型磁珠10 μL進(jìn)入含有汞液的不同編號的離心管中，然后搖勻，靜置15 min，置于磁力架上15 min后，取上層清液進(jìn)行上機(jī)測定汞濃度，比較不同粒徑的磁珠對汞的吸附效果；在磁珠材料用量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，取12個1.5 mL的塑料離心管，編號依次為1～12，用移液槍依次取10 μg/L汞液1 mL至編號后的12個塑料離心管中，分別投入粒徑為1 μm的磁珠2.5、5.0和7.0 μL至裝好汞液的不同編號的離心管中，進(jìn)行汞吸附實(shí)驗(yàn)，比較不同磁珠用量對汞的吸附效果；在優(yōu)化汞濃度的實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用2%硝酸作為溶劑分別配制3種不同濃度的汞液(1、5 和10 μg/L)，分別取1 mL至塑料離心管中，依次投入粒徑為1 μm的磁珠5 μL，進(jìn)行汞的吸附實(shí)驗(yàn)；在汞特異性吸附實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用汞單標(biāo)和含有其他多種重金屬元素的混標(biāo)制備不同濃度的重金屬全混合溶液，采用此磁珠材料對含有10種重金屬元素的全混樣進(jìn)行吸附試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中采用粒徑為1 μm的磁珠，用量為5 μL/mL，其中汞的測定采用測汞儀，其他重金屬元素的測定采用ICP-MS。

汞吸附實(shí)驗(yàn)示意圖見圖5和實(shí)驗(yàn)效果見圖6所示。

圖5 吸附示意圖Fig.5 Adsorption diagram

圖6 吸附實(shí)驗(yàn)效果圖Fig.6 Effect picture of adsorption experiment

1.8 去除率的計(jì)算

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，均保證了3個平行空白樣品，取空白樣品測定濃度的平均值為A，實(shí)驗(yàn)樣品測定濃度的平均值為B，因此去除率的計(jì)算公式如下：

去除率(%)=(A-B)/A*100

式(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 粒徑對去除效果的影響

由圖7可知，不同粒徑對汞吸附效果影響較大，磁珠粒徑為3.0 μm和0.6 μm的新型材料對汞的吸附去除率達(dá)45%，而運(yùn)用粒徑為1.0 μm的磁珠，汞去除率可達(dá)93%，且對于汞濃度為10 μg/L溶液，在磁珠加量為10 μL處理1 mL該汞液的濃度配比條件下，進(jìn)行汞吸附實(shí)驗(yàn)后，汞濃度可下降至0.6 μg/L，相較而言具有最好的吸附效果，因此選用粒徑大小為1.0 μm的新型磁珠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

圖7 不同粒徑吸附效果圖Fig.7 Adsorption effect chart of the material with different particle size

2.2 用量對去除效果的影響

由圖8可知，對于1 mL汞初始濃度為10 μg/L的溶液，當(dāng)磁珠用量為5.0與7.5 μL時，對汞均有較好的吸附效果，其中，磁珠用量為5.0 μL時，汞去除率可達(dá)96%，吸附實(shí)驗(yàn)后汞濃度為0.36 μg/L，磁珠用量加大至7.5 μL時，汞去除率變化不大，說明在用量為5.0 μL時，對溶液中汞的吸附已達(dá)到飽和狀態(tài)，因此，從吸附效果以及節(jié)省材料的角度考慮，接下來的實(shí)驗(yàn)過程中處理10 μg/L的汞液，磁珠的用量濃度為5 μL/mL。

圖8 不同磁珠用量對汞的吸附效果Fig.8 Adsorption effect for mercury with different dosage of magnetic beads

2.3 水體汞濃度對去除效果的影響

由圖9可以發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用粒徑大小為1.0 μm的磁珠在5.0 μL/mL加量的條件下進(jìn)行汞吸附實(shí)驗(yàn)后，對于汞濃度5.0和10.0 μg/L的溶液，均有較好的吸附效果，汞去除率可達(dá)89.46%，而當(dāng)溶液中汞濃度低至1.0 μg/L時，吸附效果明顯降低，且當(dāng)溶液中汞濃度達(dá)10.0 μg/L時，吸附效果更好，去除率更高。

圖9 不同汞濃度吸附效果圖Fig.9 Adsorption effect chart of different mercury concentrations

2.4 對汞的特異性吸附

由表3可知，運(yùn)用此材料對含有10種重金屬元素的溶液進(jìn)行去除實(shí)驗(yàn)后，在含有其他多種重金屬元素干擾的情況下，對汞的吸附去除率可達(dá)96%，對全混樣中鉻、錳、鎳、銅、鎘、鉛元素均沒有明顯的吸附去除效果，而對重金屬銀具有一定的吸附效果，去除率達(dá)66%，對砷、硒兩種重金屬元素均有較好的吸附去除效果，去除率均可達(dá)94%，說明此新型磁珠材料對水體環(huán)境中汞元素具有明顯的特異性吸附作用，同時此材料對水溶液環(huán)境中砷、硒兩種重金屬元素也具有明顯的特異性吸附效果。

表3 材料對不同重金屬元素的吸附效果對照表Tab.3 Comparison table of the adsorption effect of materials on different heavy metal elements

2.5 對重金屬的特異性吸附

為了進(jìn)一步研究此磁性材料對汞、砷、硒和銀4種重金屬材料的吸附機(jī)理，判斷這4種重金屬元素分別在磁珠的哪一部位進(jìn)行吸附連接，實(shí)驗(yàn)過程中，分別采用經(jīng)羧基微球偶聯(lián)胸腺嘧啶后的磁珠材料、羧基微球和裸珠3種材料對同一個含有汞、砷、硒、銀的全混樣進(jìn)行吸附試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4所示。

由表4可以看出，本實(shí)驗(yàn)制備的經(jīng)羧基微球偶聯(lián)胸腺嘧啶后的磁珠材料對汞有較好的吸附效果，去除率達(dá)97%，而羧基微球和裸珠材料對汞沒有明顯的吸附效果，說明在汞的吸附過程中，汞元素主要通過與羧基微球上偶聯(lián)的胸腺嘧啶穩(wěn)定結(jié)合，由磁力架對此材料的吸附進(jìn)而去除溶液中汞元素；羧基微球材料和磁珠材料對砷和硒元素均有較好的吸附效果，去除率可達(dá)91%，且這兩種材料對砷和硒元素的去除效果相差不大，說明在砷和硒吸附過程中，砷、硒元素主要通過與羧基微球上的羧基穩(wěn)定結(jié)合，由磁力架對此材料吸附進(jìn)而去除溶液中砷、硒元素；裸珠和羧基微球材料對銀元素均沒有明顯的吸附效果，而磁珠材料對銀的去除率為44%，說明該材料對銀有一定的吸附作用，且銀元素主要通過與羧基微球上偶聯(lián)的胸腺嘧啶結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)銀去除。

表4 不同材料對重金屬的吸附效果影響Tab.4 The effects of different materials on the adsorption of heavy metals

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)制備了粒徑大小分別為3.0、1.0和0.6 μm的3種磁性裸珠材料，通過在裸珠表面進(jìn)行羧基修飾后偶聯(lián)一定長度的胸腺嘧啶形成對溶液中汞具有一定吸附效果的新型磁珠材料，經(jīng)過對磁珠粒徑、磁珠用量以及不同汞濃度吸附去除效果的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)粒徑為1.0 μm的磁珠材料，在用量為5.0 μL/mL，處理汞濃度達(dá)10.0 μg/L的溶液時，對汞具有較好的吸附效果。

本實(shí)驗(yàn)研制的磁珠材料對水體中汞、砷、硒均有較好的吸附效果，其中汞元素主要通過與羧基微球上偶聯(lián)的胸腺嘧啶穩(wěn)定結(jié)合，砷、硒元素主要通過與羧基微球上的羧基穩(wěn)定結(jié)合，由磁力架對此材料的吸附進(jìn)而降低溶液中汞、砷、硒濃度。