張林，周劍光，甘金華，張濤，何力

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚(yú)類(lèi)種質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，湖北 武漢 430072)

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)又稱青蝦或河蝦，隸屬軟甲綱(Malacostraca)、十足目(Decapoda)、長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)[1-2]。日本沼蝦是中國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)食用蝦，廣泛分布于江河、湖泊、水庫(kù)、池塘及溝渠中。因其含有豐富的蛋白質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、生長(zhǎng)快、適應(yīng)性好、繁殖能力強(qiáng)而倍受青睞，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大。但野生群體因受自然和人為等因素的影響，產(chǎn)生棲息范圍變小、種質(zhì)資源減少、個(gè)體小型化和低齡化嚴(yán)重等問(wèn)題[3]。開(kāi)展日本沼蝦染色體研究可為遺傳改良及新品種培育提供基礎(chǔ)資料。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者已應(yīng)用 mtDNA D-Loop[2]、RAPD[4]、SSR[5]、ISSR[6]和COI[7]等技術(shù)對(duì)不同水域的日本沼蝦野生群體進(jìn)行了分析。同工酶是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，同工酶圖譜在一定條件下較為穩(wěn)定，可作為生化遺傳標(biāo)記物，用于生物種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析[8-10],然而關(guān)于日本沼蝦同工酶遺傳結(jié)構(gòu)的分析卻鮮有報(bào)道。

本研究對(duì)洪湖日本沼蝦野生群體的染色體進(jìn)行核型分析[11]，對(duì)肌肉進(jìn)行同工酶電泳[12-14]分析，開(kāi)展關(guān)于群體遺傳結(jié)構(gòu)[4,6,15-21]方面的研究，旨在完善中國(guó)日本沼蝦野生群體的種質(zhì)資源研究，為制定合理的育種方案提供數(shù)據(jù)參考。

1.1 材料來(lái)源

2018年8月和2019年10月，先后兩次在湖北洪湖采捕蝦樣共40只，鑒定定種后，體重為(4.0±0.6)g，體長(zhǎng)為(5.3±0.9)cm，充氧活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，暫養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)水蝦池。試驗(yàn)用水連續(xù)充氧，水質(zhì)良好。

1.2 染色體標(biāo)本制作

染色體標(biāo)本制備以雄蝦精巢為材料，采用林義浩的體內(nèi)注射法[22]，具體操作方法參考銀鯧(Pampusargenteus)[23]。

1.3 染色體眾數(shù)確定及組型分析

染色體眾數(shù)及組型分析參照Tan等[24]的方法進(jìn)行。具體操作方法參考銀鯧[23]。

1.4 同工酶樣本制備

將日本沼蝦個(gè)體表面水分擦干，剝殼后立即解剖，取背部肌肉置于低溫冰箱中(-20 ℃)保存?zhèn)溆?。從冷凍的組織樣品中取出0.3～0.4 g，剪碎，以1∶3的比例(重量/體積)加入蒸餾水，充分勻漿后，用高速冷凍離心機(jī)4 ℃ 12 000 rpm/min離心20 min，吸取上清液并轉(zhuǎn)入新離心管中。重復(fù)2～3次，直至上清液澄清為止。整個(gè)過(guò)程均在低溫下操作。

1.5 電泳

采用SDS-PAGE電泳。濃縮膠濃度為3.5%，分離膠濃度為7.0%。電泳緩沖液為pH 8.3的Tris-甘氨酸(TG)。每個(gè)膠孔加樣20 μL；先用280 V電壓進(jìn)行電泳，使樣品盡快進(jìn)入凝膠孔，電泳15 min，調(diào)至220 V，正式電泳開(kāi)始，于4 ℃下穩(wěn)壓進(jìn)行，待溴酚藍(lán)跑至膠塊底部終止電泳。

1.6 染色和脫色

同工酶的染色參照王中仁[25]的方法。染色后的膠片放入2.5%冰乙酸中進(jìn)行脫色。

1.7 圖譜分析與數(shù)據(jù)處理

脫色后清晰顯示的膠片，放入保存液中固定。固定好后，用水溶性透明玻璃紙將膠片包裹好，置于陰涼處晾干，制成干膠，利于長(zhǎng)期保存。對(duì)已染色和固定的膠片，進(jìn)行拍照并分析。據(jù)電泳結(jié)果判斷每種同工酶的基因型，并依據(jù)基因型計(jì)算每個(gè)等位基因的基因頻率，各參數(shù)計(jì)算參考文獻(xiàn)[26]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本沼蝦二倍體染色體數(shù)目

統(tǒng)計(jì)日本沼蝦共100個(gè)有絲分裂中期相，結(jié)果如表1所示，其中染色體總數(shù)為104的分裂相細(xì)胞占71%，確定其為二倍體，染色體數(shù)目2N=104(圖1a)。

圖1 日本沼蝦染色體中期分裂相及組型圖a：日本沼蝦染色體中期分裂相；b：日本沼蝦染色體組型圖Fig.1 Chromosme metaphase and group diagram of M.nipponensea：Metaphase of M. nipponensis chromosomes；b：Karyotype of M. nipponensis

表1 日本沼蝦染色體數(shù)目的分布Tab.1 Distribution of chromosome numbers in M. nipponense

2.2 日本沼蝦染色體組型

參考Tan等[24]的方法，測(cè)量10個(gè)日本沼蝦染色體長(zhǎng)臂與短臂長(zhǎng)度，取平均值，計(jì)算相對(duì)長(zhǎng)度、臂比及著絲粒指數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。發(fā)現(xiàn)染色體可配成52對(duì)，按Levan命名法[27]分成3組，M組(中部著絲點(diǎn)染色體，r=1.00～1.71)74對(duì)，ST組(亞端部著絲點(diǎn)染色體r=3.01～7.00)4對(duì)；T組(端部著絲點(diǎn)染色體，r=7.01～∞)11對(duì)。按相對(duì)長(zhǎng)度排列，制成組型圖(圖1b)，核型公式為2N=74M+8ST+22T，臂數(shù)NF=178。未發(fā)現(xiàn)帶有特殊標(biāo)志性特征如隨體、次縊痕的染色體，也未發(fā)現(xiàn)與性別決定有關(guān)的異形性染色體。

表2 日本沼蝦染色體核型數(shù)據(jù)Tab.2 Chromosome karyotype data of M. nipponense

2.3 日本沼蝦肌肉組織同工酶表達(dá)的差異性

2.3.1 乳酸脫氫酶(LDH)

日本沼蝦肌肉組織乳酸脫氫酶檢測(cè)到3條酶帶，存在著多態(tài)現(xiàn)象(圖2)。同工酶條帶在肌肉中的顏色均較深，表達(dá)活性均較強(qiáng)。

圖2 日本沼蝦肌肉組織LDH同工酶的電泳圖譜1-10代表10個(gè)雄蝦個(gè)體的肌肉；11-20代表10個(gè)雌蝦肌肉個(gè)體。下同。Fig.2 LDH isozyme electrophoretograms of M. Nipponense muscle tissues1-10 represent the muscles of 10 male individual shrimp;11-20 represent the muscles of 10 female individual shrimp.The same below.

2.3.2 酯酶(EST)

日本沼蝦肌肉組織酯酶表達(dá)結(jié)果如圖3，共檢測(cè)到3條酶帶，EST3顏色最深，說(shuō)明活性最強(qiáng)，其他2條帶活性也較強(qiáng)，存在多態(tài)現(xiàn)象。

圖3 日本沼蝦肌肉組織EST同工酶的電泳圖譜Fig.3 EST isozyme electrophoretograms of M. Nipponense muscle tissues

2.3.3 蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)

日本沼蝦肌肉組織蘋(píng)果酸脫氫酶表達(dá)結(jié)果如圖4，顏色較深，活性均較強(qiáng)，存在多態(tài)位點(diǎn)。

圖4 日本沼蝦MDH同工酶的電泳圖譜Fig.4 MDH isozyme electrophoretograms of M. Nipponense muscle tissues

2.4 日本沼蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)

本研究通過(guò)分析20只日本沼蝦(雌雄各10只)肌肉中3種同工酶譜帶，初步對(duì)日本沼蝦進(jìn)行了群體遺傳學(xué)研究(表3)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)共記錄10個(gè)基因位點(diǎn)，其中3個(gè)基因位點(diǎn)有多態(tài)，多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率為0.35～0.65，多態(tài)位點(diǎn)比例P為30%；等位基因數(shù)為13，位點(diǎn)平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.3；平均觀測(cè)雜合度(Ho)為0.22，平均期望雜合度(He)為0.141 5，Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)D為0.554 8。

表3 日本沼蝦群體的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)Tab.3 Genetic structures of M. Nipponense population

3 討論

3.1 日本沼蝦染色體核型分析

邱高峰等[11]曾報(bào)道日本沼蝦的初級(jí)精母細(xì)胞減數(shù)分裂前期可分為細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期5個(gè)時(shí)期，核型組成是N=52=37M+4ST+11T。本研究在顯微鏡下觀察到清晰的精原細(xì)胞有絲分裂中期染色體和精母細(xì)胞減數(shù)分裂中期二價(jià)體分裂相，經(jīng)過(guò)對(duì)染色體數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析，得到日本沼蝦精母細(xì)胞減數(shù)分裂中期二價(jià)體數(shù)目(N=52)，精原細(xì)胞有絲分裂染色體數(shù)目(2N=104)。本試驗(yàn)總結(jié)出了相對(duì)準(zhǔn)確的二價(jià)體核型公式2N=74M+8ST+22T，并提供了相應(yīng)的染色體長(zhǎng)短臂的具體數(shù)據(jù)，完善了日本沼蝦染色體核型分析的信息。

3.2 日本沼蝦同工酶表達(dá)的組織特異性分析

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)并研究的同工酶多達(dá)幾百種，常見(jiàn)的同工酶有肌酸激酶、乳酸脫氫酶、酯酶、蘋(píng)果酸脫氫酶和超氧化物歧化酶等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)日本沼蝦肌肉組織的3種同工酶進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)3種同工酶在肌肉中均高水平的表達(dá)，表達(dá)的譜帶全面。3種酶在肌肉中的分布和活性與同工酶的功能密切相關(guān)。

在高等脊椎動(dòng)物中，LDH為四聚體酶，通常有2或3個(gè)基因位點(diǎn)編碼。本實(shí)驗(yàn)中確認(rèn)有LDH-A和LDH-B2個(gè)基因編碼3個(gè)同工酶位點(diǎn)，LDH1為多態(tài)，LDH2和 LDH3位點(diǎn)均為單態(tài)。A4基因編碼的LDH1一般在無(wú)氧條件下起作用，揭示日本沼蝦肌肉無(wú)氧代謝較為旺盛，與其底棲的居住與生活習(xí)性相適應(yīng)；B4編碼的LDH2在有氧組織中表現(xiàn)出很高的活性，說(shuō)明日本沼蝦的肌肉也參與催化乳酸氧化形成丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，可能因?yàn)槿毡菊游r的肝臟系統(tǒng)不夠發(fā)達(dá)。也間接證明了日本沼蝦肌肉中不存在編碼LDH-C多肽鏈的基因，表明日本沼蝦在進(jìn)化上處于低級(jí)階段。這可能是因?yàn)檎游r屬蝦類(lèi)在淡水環(huán)境中處于食物鏈底端，選擇壓力較大所致。

酯酶是催化酯類(lèi)化合物水解的一類(lèi)復(fù)雜的酶系，在酯代謝和生物膜的結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮重要作用，有明顯的物種特異性,可為研究魚(yú)、蝦類(lèi)之間分類(lèi)地位和進(jìn)化關(guān)系提供生化指標(biāo)。魚(yú)、蝦類(lèi)的EST一般是單體或二聚體酶，以單體為主。本實(shí)驗(yàn)中日本沼蝦肌肉中EST有3個(gè)基因位點(diǎn)編碼，在肌肉中的分布無(wú)性別差異，表達(dá)水平均較高，其中EST1、EST2為單態(tài)，EST3為多態(tài)。從EST同工酶圖譜可以看出，EST在日本沼蝦肌肉中成份很高，表達(dá)活性很強(qiáng)，可能與控制該組織酯酶的基因開(kāi)啟有關(guān)，說(shuō)明其在肌肉中起著重要的生理作用。

甲殼類(lèi)蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)為二聚體酶，分為上清液型(s-MDH)和線粒體型(m-MDH)，二者相互不形成異二聚體。一般有3個(gè)座位，通常顯示出3條酶帶。

已有報(bào)道表明，青蝦MDH為7條帶[28]，雌性青蝦MDH為5條帶[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示日本沼蝦肌肉組織MDH由4個(gè)基因位點(diǎn)編碼，表達(dá)水平均較高，其中MDH2表達(dá)水平最高，MDH1～MDH3為單態(tài)，MDH4為多態(tài)。同一物種的同一種同工酶，電泳結(jié)果常常各不相同，原因可能是電泳條件不同，也可能是由于物種個(gè)體發(fā)育階段、生理狀況和環(huán)境條件不同，或基因多態(tài)性造成。

3.3 日本沼蝦群體的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)分析

認(rèn)識(shí)一個(gè)種的群體遺傳結(jié)構(gòu)有助于理解該種群的進(jìn)化過(guò)程，多態(tài)位點(diǎn)比例和平均雜合度是衡量蝦類(lèi)群體生化遺傳變異和種質(zhì)資源狀況的重要參數(shù)，研究表明魚(yú)類(lèi)多態(tài)位點(diǎn)比例大致在11.8%～41.0%，而平均雜合度為0.042 0～0.151 3。對(duì)比以上數(shù)據(jù)，本研究中得到的P值為30%，平均雜合度He為0.141 5，處于較高水平，這表明日本沼蝦野生群體的生化遺傳變異在水生生物中也處于較高水平。遺傳偏離指數(shù)(D)也能正確、全面地反映群體的遺傳平衡狀況。D值越接近零，基因分布就越接近平衡狀態(tài)，D值的正負(fù)直接反映了種群內(nèi)雜合子的過(guò)?；蛉笔顟B(tài)，D值大于0表明雜合子過(guò)剩，反之則表明雜合子缺失。本研究中日本沼蝦群體的D值為0.554 8，表明其雜合子過(guò)剩，說(shuō)明該群體遺傳變異程度較大，遺傳多樣性較高。

日本沼蝦群體的有效等位基因數(shù)Ne為1.3，硬骨魚(yú)類(lèi)的Ne為1.16～1.58，顯示日本沼蝦群體的遺傳多樣性處于中等水平。日本沼蝦野生群體的遺傳多樣性維持以選擇為主，同時(shí)受到漂變的選擇壓力。

通過(guò)以上研究可以看出，雖然取樣的日本沼蝦數(shù)量較少，但仍表現(xiàn)出雜合子過(guò)剩的情況，說(shuō)明雖然未經(jīng)人工定向改良，野生日本沼蝦群體的種質(zhì)資源庫(kù)仍有較大的變異程度，從而可以為后續(xù)的人工育種提供良好的親本。但值得注意的是，日本沼蝦的有效等位基因數(shù)偏低，其原因可能是野生日本沼蝦群體數(shù)量的下降或人為造成的地理隔離使日本沼蝦種群成為了小種群。由于長(zhǎng)江中下游大量的攔河壩已經(jīng)建成，地理隔離難以避免，因此，保護(hù)野生日本沼蝦種質(zhì)資源已成為迫切需要。目前比較可行的手段有避免過(guò)度捕撈與環(huán)境污染，防止野生日本沼蝦種群規(guī)模進(jìn)一步縮小。建議采取人工放流等手段促進(jìn)不同江段的野生日本沼蝦種群進(jìn)行基因交流，以保證日本沼蝦的遺傳多樣性。