趙璐　張蕾

摘要：為找到一種高效、環(huán)保、具備工業(yè)化潛力的無患子皂苷提取新方法，先采用加熱回流法提取無患子中的皂苷，通過單因素試驗(yàn)研究了提取溶劑類型、溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比等因素對皂苷得率的影響。在此基礎(chǔ)上，采用超聲輔助提取，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定出最具工業(yè)化潛力的無患子皂苷提取參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比1∶7、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間1 h，在此條件下無患子皂苷的得率為21.56%，比加熱回流法高44.02%，且提取時(shí)間更短、提取溫度更低。研究表明，超聲輔助加熱回流法是一種具有工業(yè)化潛力的無患子皂苷提取新工藝。

關(guān)鍵詞：無患子皂苷;加熱回流法;超聲輔助提取;得率;正交試驗(yàn)

中圖分類號：S 789文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1672-7312（2021）03-0275-06

Study on the New Technology of Ultrasonicassisted

Reflux Extraction of Sapindus SaponinsZHAO Lu1，2，ZHANG Lei1

（1.School of Geological and Environmental，Xi’an University of Science and Technology，Xi’an 710054，China;

2.Office of International Exchange and Cooperation，Xi’an University of Science and Technology，Xi’an 710054，China）Abstract：In order to find a new efficient，environmentalfriendly extraction technology with industrialization potential for Sapindus saponins，reflux method was firstly explored.The effect of solvent type，solvent volume fraction，extraction temperature，extraction time and solidliquid ratio on Sapindus saponins yield was studied by single factor experiment.On this basis，orthogonal experiment of three selected key factors of extraction temperature，extraction time and solidliquid ratio was conducted to determine the optimal condition for Sapindus saponins extraction by ultrasonicassisted reflux extraction method.The yield of Sapindus saponins was 21.56% under the optimal condition of ethanol volume fraction of 60%，solidliquid ratio of 1∶7，extraction temperature of 50 ℃ and extraction time of 1 h，which was 44.02% higher than that of reflux extraction method.，and the extraction time was shorter and the extraction temperature was lower.Ultrasonicassisted reflux extraction is a new technology for Sapindus saponin extraction with industrial potential.

Key words：sapindus saponins;reflux method;ultrasonicassisted extraction;yield;orthogonal experiment

0引言

近年來，以無患子皂苷為代表的天然表面活性劑因表面活性好、可完全降解、毒性低、生物相容性好、來源廣泛、可適應(yīng)某些極端條件等優(yōu)點(diǎn)＼[1-2＼]，被國內(nèi)外大量學(xué)者認(rèn)為具有替代化學(xué)表面活性劑的潛力＼[3＼]。無患子樹（sapindus mukurossi geartn）是一種廣泛分布于我國長江流域以南各地的植物，果皮中通常含有大量皂苷，皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)7～27 wt%＼[4＼]。皂苷主要以苷元作為疏水基團(tuán)通過醚鍵或脂鍵連接在親水糖鏈上，這樣的雙親結(jié)構(gòu)為皂苷提供了較高的表面活性，使皂苷成為一種天然的非離子表面活性劑＼[5＼]，被廣泛應(yīng)用于日化、制藥、環(huán)境修復(fù)等多個(gè)領(lǐng)域，并取得了較好的效果＼[6-7＼]。

第3期趙璐等：超聲輔助加熱回流法提取無患子皂苷新工藝的研究找到一種高效、經(jīng)濟(jì)的提取方法是無患子皂苷大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)和前提。溶劑提取法是目前皂苷提取最常用的方法之一＼[8＼]，利用甲醇、乙醇等溶劑對不同溶解度的各項(xiàng)成分進(jìn)行分步提取，具有操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是皂苷得率較低＼[9＼]，因此，常用超臨界CO2萃?。躘10＼]、亞臨界水萃?。躘11＼]、微波輔助提?。躘12＼]、減壓提?。躘13＼]等外界環(huán)境輔助的方法提高皂苷得率。DAHMOUNE等人＼[14＼]采用響應(yīng)面分析法獲得了微波輔助提取法的最優(yōu)工藝，在此條件下得到的皂苷得率比傳統(tǒng)溶劑提取法高7.82倍。BITENCOURT等人＼[15＼]研究了超臨界提取工藝順序?qū)Φ寐实挠绊?，根?jù)溶劑極性確定提取順序的原則，確定了按超臨界CO2-超臨界CO2/乙醇混合物-乙醇-水的順序依次提取的規(guī)律，指出超臨界CO2/乙醇混合是提高皂苷得率的關(guān)鍵。王維堅(jiān)＼[16＼]等人研究了超聲法提取人參總皂苷的最佳工藝，且通過與回流法對比，證明超聲法的提取效果更好。ELHAG等＼[17＼]用連續(xù)提取法從東革阿里的根中提取皂苷，利用超聲輔助-水提法的提取時(shí)間為5.5～10 min，遠(yuǎn)小于水提法20～25 min的提取時(shí)間，提取效率大幅度提高。其中，超聲輔助提取是最常用的方法之一，它利用超聲作用對溶劑產(chǎn)生的強(qiáng)沖擊、微射流，促進(jìn)有效成分與溶劑之間的固-液傳質(zhì)，同時(shí)強(qiáng)度適中、熱效應(yīng)低，可以保護(hù)有效成分的活性，提高有效成分的提取率，因此，成為天然產(chǎn)物活性組分提取工藝的研究熱點(diǎn)，然而該方法在無患子皂苷提取中的應(yīng)用還較少。

文中將以無患子果皮為原料，采用超聲輔助-加熱回流法提取皂苷，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取提取溫度、溫度時(shí)間、料液比3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以期找到一種高效、環(huán)保、具備工業(yè)化潛力的無患子皂苷提取方法。

1實(shí)驗(yàn)原料及方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

無患子果皮：安國市仟曹御顏坊中藥材有限公司;無水乙醇：分析純級，天津富宇精細(xì)化工有限公司;甲醇：分析純級，天津市大茂化學(xué)試劑廠;丙酮：分析純級，天津富宇精細(xì)化工有限公司;香草醛：分析純級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;濃硫酸：分析純級，天津市富宇精細(xì)化工有限公司;冰醋酸：分析純級，天津市富宇精細(xì)化工有限公司;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海麥克林生物化學(xué)有限公司;溴化鉀：光譜純級，上海麥克林生物化學(xué)有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1無患子皂苷含量的測定

由于無患子果皮中含有的皂苷主要為齊墩果酸三萜皂苷，目前研究均以齊墩果酸作為無患子皂苷含量評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品。文中通過繪制標(biāo)準(zhǔn)品的濃度-質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定樣品中的皂苷含量。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：稱取干燥的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg加入無水乙醇使其定容到25 mL，得到0.1 mg/mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)備8支干燥潔凈的10 mL具塞試管，移取0.1 mg/mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1 mL分別加入其中，將試管置于80℃真空干燥箱中使溶劑完全揮發(fā)，然后向每只試管依次加入0.2 mL的5%香草醛-冰醋酸顯色溶液和0.8 mL濃硫酸，搖勻后在60℃恒溫水浴鍋（W501型，上海申順生物科技有限公司）中加熱15 min，顯色停止后立即將試管置于冰水中3 min，待冷卻后再向每只試管加入5 mL冰醋酸，搖晃均勻后，用紫外分光光度計(jì)（UV-5，瑞士梅特勒-托利多公司）在400～600 nm掃描光譜，確定最大吸收波長，在該波長下測定溶液吸光度的值。用加入0 mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的試管做參照對比。5%的香草醛-冰醋酸溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。稱取一定量的本實(shí)驗(yàn)得到的無患子皂苷提取物，溶解于無水乙醇中，用25 mL的容量瓶定容，配制成無患子皂苷的測試溶液，用移液管精確稱取0.1 mL測試溶液至比色管，用香草醛-濃硫酸顯色法測定樣品溶液的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算皂苷含量和皂苷提取率。

1.2.2無患子提取工藝研究

將市購的無患子果殼用清水洗凈后烘干，用粉碎機(jī)粉碎到粉末狀過篩（100目標(biāo)準(zhǔn)篩），稱取一定量的無患子果皮粉末與溶劑混勻在不同條件下提取，得到的提取液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后在離心機(jī)中（6-16S型，德國Sigma公司）以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取出上清液再進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（RE-2000A型，上海亞榮公司）得到膏狀濃縮物，置于冰箱中冷藏可結(jié)晶得到固態(tài)的皂苷提取物，提取流程如圖1所示。

1）常規(guī)溶劑加熱回流提取：考察不同提取溶劑種類（水、乙醇、甲醇、丙酮）、提取溶劑體積分?jǐn)?shù)（15%、30%、45%、60%、75%、100%），提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、3、4 h）、料液比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶0、1∶15∶1∶20）對皂苷得率的影響。

2）超聲輔助加熱回流提取：在單因素的基礎(chǔ)上，采用恒溫超聲波提取機(jī)（VS-65UE型，無錫沃信儀器有限公司）產(chǎn)生的超聲輔助提取，選定超聲功率為100 W（無患子皂苷超聲輔助提取及洗滌性能研究），選取提取溫度、提取時(shí)間和料液比3個(gè)因素通過正交試驗(yàn)法，以皂苷得率為目標(biāo)函數(shù)優(yōu)化工藝。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1無患子皂苷總含量的測定

由于齊墩果酸型五環(huán)三萜皂苷沒有共軛體系，因此需要通過三萜皂苷在硫酸、高氯酸等Lewis酸作用下，經(jīng)過脫水、雙鍵位移、縮合等一系列反應(yīng)產(chǎn)生有色或熒光物質(zhì)來進(jìn)行定量＼[7＼]。無患子皂苷提取物和香草醛進(jìn)行顯色反應(yīng)后，在540 nm波長處有較大吸收峰（圖2），因此將540 nm選為吸光度測試波長，測定不同質(zhì)量齊墩果酸對應(yīng)吸光度的值，擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），進(jìn)行線性回歸后得到方程：y=0.005 9 x+0.062 57（R2=0.992 1），說明齊墩果酸在30～210 μg范圍內(nèi)，與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可作為齊墩果酸型皂苷含量評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2無患子皂苷提取工藝研究

2.2.1加熱回流法提取皂苷工藝

1）提取溶劑對無患子皂苷含量的影響。溶劑的種類直接影響其穿透無患子細(xì)胞的能力，進(jìn)而影響皂苷的提取率。皂苷類化合物分子具有雙親結(jié)構(gòu)，可用水或甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑提取。分別取40 mL去離子水、100%乙醇、100%甲醇、100%丙酮與4.0 g無患子果皮粉末按1∶10的料液比混合均勻，在60 ℃條件下提取2 h，無患子皂苷的得率如圖4所示?？梢钥闯觯c3種有機(jī)溶劑提取無患子皂苷的得率相較，用水提取皂苷的得率最低，僅為6.51±1.04%。在3種有機(jī)溶劑中，甲醇作為溶劑提取的無患子皂苷得率最高，達(dá)到13.48±0.83%，這與金秋等人的研究結(jié)果一致＼[17＼]。然而由于甲醇具有毒性，并且溶解度高，在無患子提取過程中一些單糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)也會被提取出來，降低了提取物中的皂苷純度，不宜用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。用乙醇提取無患子皂苷的得率為10.91±1.34%，稍低于甲醇的得率，考慮到提取物的純度、生產(chǎn)過程及產(chǎn)品的安全性等因素，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將選擇乙醇作為無患子皂苷的提取溶劑。

2）乙醇體積分?jǐn)?shù)對無患子皂苷含量的影響。乙醇的體積分?jǐn)?shù)決定了無患子果皮細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓大小，影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的滲出和皂苷得率。分別取40 mL體積分?jǐn)?shù)為15%、30%、45%、60%、80%，100%的乙醇與4.0 g無患子果皮的粉末按1：10的料液比混合均勻，在60 ℃條件下提取2 h，無患子皂苷的得率如圖5所示。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%～90%的范圍內(nèi)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，無患子皂苷的得率先增大后減小。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由15%增大到60%時(shí)，無患子皂苷的得率也由6.02±0.39%增加到14.97±0.55%，達(dá)到皂苷得率的最大值。而后，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)由60%繼續(xù)增大到90%時(shí)，皂苷得率逐漸減小。這可能是因?yàn)椴糠衷碥疹惢衔锸撬苄晕镔|(zhì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，一些雜質(zhì)溶出增多，與水溶性皂苷競爭溶劑，導(dǎo)致皂苷溶出減少，使皂苷的得率下降。因此，選擇體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇作為提取溶劑，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件。

3）提取溫度對無患子皂苷含量的影響。溫度會影響乙醇分子和無患子果皮中各類物質(zhì)的運(yùn)動速度和擴(kuò)散速度，進(jìn)而影響皂苷的得率。取40 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液與4.0 g無患子果皮粉末按1∶10的料液比混合均勻，分別在30、40、50、60、70、80 ℃條件下提取2 h，得到無患子皂苷的得率如圖6所示。由圖可以看到，在30～60 ℃范圍內(nèi)，皂苷得率隨溫度的上升快速增加，由7.66±0.73%增至15.32±0.29%。這是因?yàn)闊o患子皂苷易溶于乙醇，隨著溫度升高，無患子果皮中各物質(zhì)分子運(yùn)動更激烈，擴(kuò)散的速度也更快，有助于皂苷遷移溶出。當(dāng)提取溫度由60 ℃升至70 ℃時(shí)，皂苷提取率略有上升，變化不明顯。超過70 ℃后，隨溫度上升，皂苷得率開始下降。這可能是因?yàn)闇囟冗^高破壞了無患子皂苷的活性成分，造成部分皂苷水解，生成副產(chǎn)物，皂苷提取率下降，影響提取物純度及后續(xù)的利用＼[18＼]。可以看到，在30～80 ℃的范圍內(nèi)，隨提取溫度的升高，無患子皂苷得率先增加后減少。為了降低能耗，并保證無患子皂苷得率較高，在工業(yè)化提取無患子皂苷時(shí)可將提取溫度設(shè)定在60 ℃。

4）提取時(shí)間對無患子皂苷含量的影響。提取時(shí)間決定了無患子果皮與溶劑的相互作用是否充分，從而影響無患子皂苷得率。取40 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液與4.0 g無患子果皮粉末按1∶10的料液比混合均勻，在60 ℃條件下分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h，無患子皂苷得率如圖7所示。可以看到，隨著提取時(shí)間由0.5 h增加至2.0 h，無患子皂苷的得率從6.94±0.38%迅速增加到14.97±0.55%，增幅達(dá)115.71%。而當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加2 h達(dá)到4.0 h時(shí)，皂苷得率增至16.37±0.85%，但增幅僅為9.35%。在0.5～4 h范圍內(nèi)，隨提取時(shí)間的增長，無患子皂苷的得率先快速增加后趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)?，隨著提取時(shí)間的增加，無患子果皮中的各物質(zhì)組分會逐漸擴(kuò)散到溶劑中，當(dāng)溶于溶劑中的組分逐步溶解到達(dá)一定濃度后，其擴(kuò)散速度變緩，物質(zhì)的量趨于平衡＼[19＼]。在實(shí)驗(yàn)中，提取時(shí)間達(dá)到2.0 h就基本能完全提取無患子中的皂苷成分，再增加提取時(shí)間不僅在工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)增加能耗，還有可能使更多雜質(zhì)析出，影響皂苷質(zhì)量，因此將提取時(shí)間設(shè)定為2.0 h。

5）料液比對無患子皂苷含量的影響。料液比是皂苷提取過程中影響提取率的重要因素。如果料液比太小則對皂苷提取不足，料液比太大會造成提取液后處理的工作量大，且增加成本，因此必須選擇合適的料液比提取皂苷。分別取體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液16、24、32、40、60、80 mL與4.0 g無患子果皮粉末按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20的料液比混合均勻，在60 ℃條件下提取2 h，得到料液比與無患子皂苷得率的關(guān)系如圖8所示。在料液比為1∶4～1∶20的范圍內(nèi)，隨著溶劑的增加，無患子皂苷的得率先增加后減小。無患子皂苷的提取是依靠固-液濃度差作為推動力，在料液比為1∶4～1∶10范圍內(nèi)，隨提取溶劑占比的增加，溶劑量越大，物質(zhì)與溶劑之間濃度差就越大，推動力就越大，越有利于皂苷的傳質(zhì)速率＼[20＼]，因此皂苷的提取率由8.77±1.26%增加了近一倍，達(dá)到1497±0.55%。然而，在料液比由1∶10繼續(xù)增大到1∶20的過程中，溶劑量過大，不利于皂苷與乙醇間充分循環(huán)交換＼[21＼]，此外，還會有其它雜質(zhì)析出進(jìn)入體系，使浸提液黏度增大，擴(kuò)散速度變慢，導(dǎo)致皂苷類化合物難溶出，因此，皂苷的提取率逐漸降低。因此，在料液比為1∶10，即提取溶劑乙醇的量為無患子果皮粉末質(zhì)量的10倍時(shí)有利于無患子皂苷提取的工業(yè)化應(yīng)用。

通過單因素實(shí)驗(yàn)，得到采取常規(guī)加熱回流法提取皂苷時(shí)，適用于工業(yè)化應(yīng)用的工藝條件為：取無患子果皮粉末與體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇以料液比1∶10混合，在60 ℃條件下提取2 h，可以得到無患子皂苷的得率為14.97%，該得率較低，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2.2超聲輔助加熱回流提取工藝的研究

超聲波可以提供能量，將強(qiáng)烈的震動能傳遞給無患子粉末和溶劑，粉碎無患子細(xì)胞，加快胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，提高皂苷得率。因此，在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用超聲輔助的方法，分別選取提取時(shí)間0.75 h、1.0 h、2.0 h，料液比1∶3、1∶7、1∶10，提取溫度40 ℃、50 ℃、60 ℃進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，直觀分析和方差分析結(jié)果見表1。

由表1可以看到，借助超聲輔助加熱回流法提取的皂苷得率（13.13%～21.56%）比常規(guī)加熱回流法提取的皂苷得率（5.57%～14.97%）有顯著提高。按照極值分析，各因素對無患子皂苷得率的影響從大到小排序?yàn)椋禾崛r(shí)間（A）>提取溫度（C）>料液比（B）。以得率為目標(biāo)函數(shù)時(shí)，各因素應(yīng)選擇具有較大K值的水平，各因素最佳水平為A2B3C3，即最佳工藝條件為：提取時(shí)間1.0 h，提取溫度50 ℃，料液比為1∶10。由于料液比對皂苷得率影響最小，為了降低提取成本，最終選擇料液比1∶7作為提取條件，在此條件下無患子皂苷的得率為21.56%，比常規(guī)加熱回流法工業(yè)化條件下提取的皂苷得率提高了44.02%。

3.結(jié)論

1）采用加熱回流法提取無患子中皂苷時(shí)，在單因素實(shí)驗(yàn)中，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)（15%～100%）、提取溫度（30 ℃～90 ℃）、料液比（1∶4～1∶20）的增大，皂苷得率先升高再下降。隨提取時(shí)間（0.5～4.0 h）的增加，皂苷得率持續(xù)增加。綜合考慮皂苷得率及成本，最終確定加熱回流法提取皂苷的工藝參數(shù)為：無患子果皮粉末與體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇以料液比1∶10混合，在60℃條件下提取2 h，此時(shí)無患子皂苷的得率為14.97%。

2）采用超聲輔助加熱回流法提取時(shí)，通過正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素按照對得率的影響的主次關(guān)系為：提取時(shí)間>提取溫度>料液比，最具工業(yè)化應(yīng)用潛力的工藝條件為：無患子果皮粉末與體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇以料液比1：7混合，在50 ℃下提取1 h，在此條件下無患子皂苷的得率為21.56%，與加熱回流法相比提高了44.02%。

3）超聲輔助加熱回流法不僅可以通過強(qiáng)度適中的超聲作用產(chǎn)生能量有效促進(jìn)皂苷和乙醇之間的固-液傳質(zhì)，還能夠縮短提取時(shí)間、降低提取溫度、節(jié)省溶劑，且該工藝設(shè)備簡單能耗小，是一種具有工業(yè)化潛力的無患子皂苷提取新方法。

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