劉延忠，劉東升，朱旭江，姚世霞

（1.甘肅省醫(yī)療器械檢驗檢測所，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州730070）

中藥飲片作為中藥提取物和中成藥的基本原料，市場需求量大，染色劑染色偽制的常用中藥飲片的外觀性狀接近正品，不易辨別，導致不法分子將假、劣藥材染色后冒充正品[1－2]。據(jù)報道，大部分黃色類染色劑不利于人體健康，如金胺O、金橙Ⅱ等黃色素類染色劑對人體可造成不同程度危害，故禁止用于中藥飲片的染色。近年來，雖然藥監(jiān)部門加大了中藥非法染色的打擊力度，金胺O等染色劑的染色現(xiàn)象有所減少，但仍有不法商販使用其他黃色素類染色劑進行非法染色。目前，國家藥品監(jiān)督管理局已頒布的中藥飲片染色摻假物質(zhì)補充檢驗多采用薄層色譜（TLC）法、高效液相色譜（HPLC）法對單個藥材及飲片中的一種或幾種色素進行檢測[3－4]，品種覆蓋面窄，檢測方法靈敏度低，準確性差，易出現(xiàn)假陽性，不能有效控制中藥飲片的質(zhì)量。超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC－MS／MS）廣泛用于中藥非法染色劑的檢測[5－14]。本研究中建立了同時測定蒲黃、黃芪、黃連、黃柏和延胡索等多種中藥飲片中8種黃色素類染色劑含量的UPLC－MS／MS法，為中藥飲片中黃色素類染色劑的檢測提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LCMS－8045型超高效液相色譜－三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）；ME204型和MS205DU型分析天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度均為0.01 mg）；KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；XK80－A型快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；SHY－2A型多功能水浴恒溫振蕩器（金壇市大地自動化儀器廠）；5430R型離心機（德國艾本德公司）；HGC－24A型氮氣吹干儀（天津市高科技發(fā)展有限公司）；Research plus加樣槍（德國艾本德公司，規(guī)格為10，100 μL）；Xiboshi一次性針式過濾器（美國戴安公司，規(guī)格為0.22，0.45 μm）。

1.2 試藥

檸檬黃對照品（批號為30117，純度為90.0%）；日落黃對照品（批號為91001，純度為87.0%），金胺O對照品（批號為00701，純度為79.0%），金橙Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枮?1116，純度為96.3%），堿性橙22對照品(批號為6A16a050，純 度 為91.5%)，均 購 于Dr.Ehrenstorfer GmbH；金橙Ⅰ對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號為S11N8D48136，純度≥98%)；燦爛黃對照品(批號為A2689A，純度為95%)，皂黃對照品（批號為D1714050，純度為98%），均購于上海Aladdin公司；乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸銨均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。藥材樣品信息見表1。

表1 藥材樣品信息Tab.1 Information of Chinese herbal pieces

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC－MS／MS條件

色譜條件：色譜柱為Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm）；流動相為乙腈（A）－0.02 mol／L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫(0～12 min時90%B→55%B，12～20 min時55%B→30%B，20～40 min,時30%B→15%B)；流速為0.2 mL／min；柱溫為30℃；進樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為正離子電噴霧離子源（ESI＋），反應監(jiān)測模式（MRM）；DL管溫度為350℃；干燥氣流速為10 L／min；霧化氣流速為3.0 L／min；接口電壓為4.0 kV?？傠x子流圖見圖1，各成分質(zhì)譜信息見表2。

表2 8種黃色表類染色劑質(zhì)譜信息Tab.2 Mass spectrum information of eigh yellow pigments

圖1 8種黃色素類染色劑混合對照（中等線性濃度）的總離子流圖1.Lemon yellow 2.Sunset yellow 3.Brilliant yellow 4.OrangeⅠ5.Golden orangeⅡ6.Auramine O 7.Soap yellow 8.Alkaline orange 22Fig.1 Total ion flow diagram of mixed reference（medium linear concentration）of eight yellow pigments agents

2.2 溶液制備

分別取檸檬黃、日落黃、金橙Ⅰ、燦爛黃、金胺O、金橙Ⅱ、皂黃和堿性橙22對照品各10 mg，精密稱定，加70%乙醇分別制成質(zhì)量濃度為100 μg／mL的單標混合貯備液，于4℃條件下保存。取上述單標混合貯備液各1～3 mL，置50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。取樣品適量，粉碎，取2.0 g，精密稱定，加70%乙醇20 mL，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，冷卻至室溫，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察和檢測限確定：分別精密吸取2.2項下稀釋1倍后的單標混合貯備液，加70%乙醇，分別制成系列混合對照品溶液。注入超高效液相色譜－三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，按2.1項下色譜條件測定染色劑的峰面積積分值。以混合對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X，μg／mL）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到近原點的一條直線，計算回歸方程和相關系數(shù)。結(jié)果見表3?？梢姡?種黃色類染色劑質(zhì)量濃度在0.2～30.0 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。方法的檢測限為0.05～0.10 μg／g。詳見表3。

表3 8種黃色素類染色劑回歸方程、線性范圍和檢測限Tab.3 Regression equation，linear range and LOD of eight yellow pigments

精密度和準確度試驗：采用標準添加法，稱取完全不含染色劑的空白樣品6份，每份1.0 g，精密稱定，分別精密加入混合對照品溶液各2 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果平均回收率為89.83%～99.52%，RSD為2.14%～3.67%（n＝6）。詳見表4。

表4 精密度和準確度試驗結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of precision and accuracy tests（n＝6）

2.4 樣品中非法添加黃色素類染色劑檢測

采用UPLC－MS／MS法，按2.1項下色譜條件對26批蒲黃（2批）、黃芪、黃連、黃柏和延胡索（各6批）樣品中非法添加黃色素類染色劑進行檢測，結(jié)果樣品均未檢出黃色素類染色劑。

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化

曾考察不同提取溶液(甲醇、乙醇、70%甲醇溶液、70%乙醇溶液)對測定結(jié)果的影響，結(jié)果經(jīng)70%乙醇溶液提取，供試品溶液進樣后色譜峰峰形良好，且雜峰較少。綜合考慮，以70%乙醇溶液為提取溶劑?？疾觳煌崛》椒?浸泡、超聲、回流提取法)對測定結(jié)果的影響，結(jié)果超聲提取法簡便、快捷，且提取效率較高，故采用超聲提取法?？疾觳煌w積(10，20，30，50 mL)的70%乙醇溶液和不同超聲時間(15，30，45，60 min)對測定結(jié)果的影響，最終選用20 mL 70%乙醇溶液超聲處理30 min。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)8種染色劑分子的結(jié)構(gòu)特征，分別在正離子和負離子模式下進行全掃描，結(jié)果在正離子模式下各染色劑的響應值均高于負離子模式下的響應值，故選用正離子模式；通過UPLC的自動進樣器直接進樣（不連接色譜柱），對毛細管電壓、錐孔電壓及質(zhì)譜分辨率等條件進行優(yōu)化，確定接口電壓為4.0 kV。在擬訂質(zhì)譜條件下，分別以分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描，選取響應最高且干擾較小的子離子作為定量離子（MRM模式），以響應值次之的作為定性離子，并對目標化合物二級質(zhì)譜的碰撞能量等質(zhì)譜分析參數(shù)進行優(yōu)化。最終確定了質(zhì)譜條件。

3.3 流動相優(yōu)化

在質(zhì)譜分析過程中，由于待測樣品（陽性含染色劑）中含有偶氮鍵和季銨鹽，故流動相中常加入一定濃度的甲酸和銨鹽（甲酸銨或乙酸銨），有助于正離子的響應和峰形的改善。選擇乙腈－0.02 mol／L乙酸銨溶液、甲醇－0.02 mol／L乙酸銨溶液、乙腈－0.02 mol／L甲酸銨溶液和甲醇－0.02 mol／L甲酸銨溶液4種流動相體系進行分析。結(jié)果顯示，采用乙腈－乙酸銨體系進行梯度洗脫時，樣品分離度和峰形均較好，且能進一步提高分析樣品的信噪比和靈敏度。

3.4 方法評價

本研究中建立了同時測定中藥飲片中可能添加的8種黃色素類染色劑的UPLC－MS／MS法，該方法穩(wěn)定性好，可操作性強，準確度高，提高了工作效率，降低了檢測成本。與HPLC法相比，進一步提高了方法的準確度和靈敏度，檢測的色素種類較全面，有效地提高了檢測速度，可為監(jiān)測中藥飲片中非法染色提供參考。