陳明軍，張燕，金新莉，呂永磊，方建華

(河南省紅十字血液中心，河南 鄭州 450012)

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是一種引起獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的逆轉(zhuǎn)錄病毒，通過抑制特異性抗體形成和維持有效的殺傷性T細(xì)胞活性進(jìn)行性破壞免疫系統(tǒng)，嚴(yán)重危害患者身體健康[1]。截至2018年9月30日，中國報(bào)告現(xiàn)存活HIV感染者/AIDS患者849 602例，報(bào)告死亡262 442例[2]。血液傳播是HIV最主要的傳播途徑之一，目前HIV檢測(cè)主要標(biāo)志物有抗原、抗體和RNA。由于RNA在血漿中出現(xiàn)最早，且能無限擴(kuò)增，所以核酸檢測(cè)技術(shù)能縮短檢測(cè)“窗口期”，提高檢測(cè)靈敏度。但HIV基因型復(fù)雜多樣[3]，且相比抗原抗體，RNA穩(wěn)定性較差，對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求較高。因此，抗原抗體檢測(cè)在血液篩查中具有不可替代的作用。常用的抗原抗體檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析試驗(yàn)(chemiluminescence analysis，CLIA)2種，由于CLIA儀器試劑比較昂貴等原因，目前在醫(yī)院應(yīng)用較多，而血站多采用ELISA方法。CLIA和ELISA都有第3代和第4代 2種試劑，第4代是抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑，在第3代基礎(chǔ)上增加了P24抗原檢測(cè)功能[4]，在一定程度上彌補(bǔ)了抗體血清轉(zhuǎn)換期較長的缺點(diǎn)。為了客觀地了解和評(píng)估CLIA在血液篩查上的應(yīng)用價(jià)值，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心牽頭組織開展了化學(xué)發(fā)光多中心評(píng)估項(xiàng)目。本文通過分析河南省紅十字血液中心實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果，探討國產(chǎn)第4代CLIA試劑的檢測(cè)性能?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心提供的4套血清盤(編號(hào)A、B、C、D)，共330份樣本，其中各血站HIV陽性獻(xiàn)血者標(biāo)本149份，陰性獻(xiàn)血者標(biāo)本78份，結(jié)果不確定樣本5份[免疫印跡(Western blot，WB)出現(xiàn)任何特異性條帶，但不足以判斷為陽性]，特殊樣本98份(陰性質(zhì)控品13份，2種陽性質(zhì)控品共63份，稀釋樣本10份，病毒培養(yǎng)液標(biāo)本12份)。每套血清盤均設(shè)有陰性質(zhì)控(n)和2種不同水平的陽性質(zhì)控(C1，C2)。臨床檢驗(yàn)中心使用8種ELISA試劑和7種CLIA試劑對(duì)血清盤標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)，如均為陰性則確認(rèn)結(jié)果為陰性，反之判為陽性；結(jié)果不一致時(shí)核酸檢測(cè)(nucleic acid testing，NAT)陽性則確認(rèn)結(jié)果為陽性；如核酸結(jié)果為陰性，再根據(jù)WB判斷，根據(jù)顯示的條帶最終分為陽性、陰性和不確定3種。

1.2 儀器與試劑儀器：STAR全自動(dòng)加樣器(瑞士HAMILTON公司)、FAME全自動(dòng)酶免分析儀(瑞士HAMILTON公司)、KUBOTA8420臺(tái)式離心機(jī)(日本久保田)、340RT HT3恒溫酶標(biāo)儀(奧地利Anthos公司)、AutoLumo A2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀(鄭州安圖)。試劑：第3代HIV酶免試劑(北京萬泰，批號(hào)I20170614、I20170617)、第4代HIV酶免試劑(法國伯樂，批號(hào)7G0400、7H0405)、第3代HIV抗體化學(xué)發(fā)光試劑(鄭州安圖，批號(hào)20170923)、第4代HIV抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)化學(xué)發(fā)光試劑(鄭州安圖，批號(hào)20171023)。以上試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 檢測(cè)方法分別采用2種酶免試劑和2種化學(xué)發(fā)光試劑嚴(yán)格按照試劑說明書要求對(duì)330份血清盤標(biāo)本進(jìn)行HIV檢測(cè)。當(dāng)S/CO≥1時(shí)則判為該試劑檢測(cè)結(jié)果為陽性，<1為陰性。梯度稀釋標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果≥1表示檢測(cè)出，否則為未檢測(cè)出。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用Excel 2010計(jì)算批內(nèi)和批間精密度。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。不同試劑檢測(cè)結(jié)果的比較采用McNemar檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一致性檢驗(yàn)采用Kappa系數(shù)檢驗(yàn)，K≥0.75表示有較高的一致性，K>0.8表示有極好的一致性。去掉7份不確定樣本和96份特殊樣本，根據(jù)227份血清盤樣本檢測(cè)結(jié)果計(jì)算以下評(píng)價(jià)指標(biāo)：靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和Youden指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 批內(nèi)精密度4種試劑2個(gè)水平質(zhì)控品的批內(nèi)變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)都控制在10%以內(nèi)。ELISA試劑的批內(nèi)CV小于CLIA。見表1～2。

表1 A、C血清盤C1濃度批內(nèi)精密度

表2 B、C血清盤C2水平批內(nèi)精密度

2.2 批間精密度4種試劑2個(gè)水平質(zhì)控品的批間CV都小于15%。CLIA試劑的批間CV小于ELISA。見表3。

表3 4種試劑2個(gè)不同水平質(zhì)控的批間精密度

2.3 一致性分析2種第4代試劑的陽性符合率最高，陰性符合率最低。見表4。

表4 第4代CLIA試劑與其他3種試劑的一致性分析

2.4 4代試劑假陽性標(biāo)本分析2種第4代試劑共檢測(cè)出8份與確認(rèn)結(jié)果不相符的標(biāo)本，其中有6份(HIV D 52，HIV D 54，HIV D 55，HIV D 63，HIV B 64，HIV A 67)均為第4代ELISA試劑假陽性。見表5。

表5 2種第4代試劑與確認(rèn)結(jié)果不符標(biāo)本分析

2.5 稀釋靈敏度4種試劑中除了第3代CLIA試劑，其他均能檢測(cè)出2個(gè)1∶800的稀釋標(biāo)本。見表6。

表6 梯度稀釋標(biāo)本各試劑的檢測(cè)結(jié)果

2.6 性能評(píng)價(jià)指標(biāo)4種試劑中2種第4代試劑的靈敏度最高，第4代CLIA和第3代ELISA的特異度最好。見表7。

表7 4種試劑血清盤檢測(cè)效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)/%

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，HIV檢測(cè)技術(shù)也在不斷改進(jìn)和更新。CLIA是繼酶聯(lián)免疫分析、放射免疫分析和熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一種新興標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。CLIA包括磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法和電化學(xué)發(fā)光法2種，本文探討的是前者，它充分利用了磁性分離技術(shù)的快速、易自動(dòng)化以及化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏度和免疫分析技術(shù)的高特異度等優(yōu)勢(shì)，是檢測(cè)微量抗原抗體比較理想的方法。

按照國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心的統(tǒng)一部署和要求，本研究采用ELISA和CLIA 2種方法、4種試劑分別對(duì)330份無償獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。通過精密度評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)4種試劑均具有良好的重復(fù)性，批內(nèi)CV都小于10%，與相關(guān)報(bào)道[5-6]相近?？傮w上，ELISA試劑的批內(nèi)精密度要好于CLIA試劑，這可能是由于ELISA采用的是板式加樣，對(duì)各微孔的處理幾乎完全一樣，所以得到的結(jié)果也十分接近，而CLIA采用自由上樣，標(biāo)本間的處理存在一定時(shí)間和空間差。相反，ELISA試劑的批間精密度不如CLIA試劑，這是由于CLIA自動(dòng)一體化程度較高，且全封閉，步驟少，時(shí)間短，受外界因素干擾較少。另外，第4代CLIA的批內(nèi)和批間CV均小于第3代，表明第4代試劑重復(fù)性和穩(wěn)定性更佳。

ELISA試劑是國內(nèi)所有血站都在使用的一種血液篩查試劑，試劑盒及實(shí)驗(yàn)技術(shù)都已十分成熟[7-8]。為了評(píng)價(jià)第4代CLIA試劑是否具有相似的檢測(cè)能力，本研究對(duì)第4代CLIA試劑與其他3種試劑分別進(jìn)行了符合性分析。從結(jié)果看，2種第4代試劑的陽性符合率最高，陰性符合率較低；Kappa系數(shù)檢驗(yàn)表明4代CLIA試劑與其他試劑均具有極佳的一致性；McNemar檢驗(yàn)結(jié)果也顯示第4代CLIA試劑與其他3種試劑的檢測(cè)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本文檢測(cè)的227份普通血清盤標(biāo)本均來自于無償獻(xiàn)血者，所以通過以上結(jié)果，可認(rèn)為第4代CLIA可以作為ELISA的替代試劑用于獻(xiàn)血者的HIV篩查。本試驗(yàn)中，共有8份4代試劑與確認(rèn)結(jié)果不符的標(biāo)本，其中有6份均為第4代ELISA試劑假陽性，這也是導(dǎo)致表4中2種第4代試劑陰性符合率最低的主要原因。HIV D 19號(hào)標(biāo)本NAT檢測(cè)結(jié)果為陽性，所以該標(biāo)本中可能存在很低水平的P24抗原而被第4代CLIA試劑檢出，可以推測(cè)第4代CLIA試劑在微量抗原檢測(cè)能力上優(yōu)于第4代ELISA試劑。HIV D 44標(biāo)本2種CLIA試劑均為假陽性，這可能是由于這2種試劑均來自同一廠家，而標(biāo)本中恰有能與該廠家試劑發(fā)生交叉反應(yīng)的干擾物質(zhì)存在。梯度稀釋標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示除了第3代CLIA試劑外其他3種試劑均能檢測(cè)出2個(gè)1∶800的抗體稀釋標(biāo)本，表明這3種試劑稀釋靈敏度較好，而第3代CLIA試劑對(duì)低水平標(biāo)本的檢測(cè)能力還有待進(jìn)一步提高。

為了更加直觀地展示各試劑的檢測(cè)性能，選擇性計(jì)算了幾個(gè)常見的評(píng)價(jià)指標(biāo)。從結(jié)果看，第4代CLIA試劑的各項(xiàng)指標(biāo)均是所有試劑中最優(yōu)秀的，與其他文獻(xiàn)[9-11]結(jié)論一致。其中，2種第4代試劑靈敏度均達(dá)到100%，表明陽性標(biāo)本無一漏檢。另據(jù)報(bào)道，第4代ELISA試劑存在較高的假陽性率，在低感染率人群中尤為明顯[12-13]。本研究中也出現(xiàn)了6份第4代ELISA假陽性，遠(yuǎn)高于其他試劑，所以雖然靈敏度相同，但其特異度、準(zhǔn)確度及Youden指數(shù)等指標(biāo)不如第4代CLIA試劑。這也意味著如果第4代CLIA試劑用于無償獻(xiàn)血者標(biāo)本篩檢不僅可以保證較高的檢出率，而且還能減少不必要的血液報(bào)廢，防止合格的血標(biāo)本流失。

另外，在試驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)了CLIA檢測(cè)系統(tǒng)一些操作上的優(yōu)點(diǎn)。首先該檢測(cè)系統(tǒng)可以自由隨機(jī)上樣，檢測(cè)項(xiàng)目能靈活組合試驗(yàn)時(shí)間等，因此對(duì)有疑問的標(biāo)本可以立即復(fù)檢，40 min就可出結(jié)果，這對(duì)血小板等一些保質(zhì)期很短的血制品和急救用血來說具有十分重要的意義。CLIA試劑采用彈性膜密封，可以有效防止蒸發(fā)，并且化學(xué)發(fā)光儀具有冷藏功能，剩余的試劑無需取出可直接存放于儀器上。同時(shí)每種試劑均有條形碼，可直接掃碼使用，避免了ELISA試驗(yàn)中倒錯(cuò)試劑、貼錯(cuò)條碼等常見的人為失誤。最后，該檢測(cè)系統(tǒng)全自動(dòng)一體化程度高于目前ELISA試驗(yàn)常用的STAR-FAME系統(tǒng)，可以真正地實(shí)現(xiàn)無人值守模式，更加適合工作量較大的實(shí)驗(yàn)室使用。

總之，本研究表明CLIA比目前常用的ELISA血液篩查試劑檢測(cè)性能更優(yōu)，且具有較好的可操作性，值得在血液篩查中推廣使用。