高忠林 權(quán)浩浩 張曉鳳 程小紅

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)2019級碩士研究生，陜西 咸陽 712000)

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是一種常見的生化異常，由尿酸鹽生成過多或(和)腎臟尿酸排泄減少，或者兩者共同存在而引起的[1]。根據(jù)其發(fā)病機(jī)制的差異分為原發(fā)性HUA和繼發(fā)性HUA，原發(fā)性HUA多由基因突變引起，屬遺傳??；繼發(fā)性HUA常由腎臟病、藥物、血液病等引發(fā)。隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，HUA發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]，據(jù)統(tǒng)計(jì)高達(dá)21%的人群和25%的住院患者有無癥狀HUA[3]。因此，降低血清尿酸值是臨床上常用的防治HUA措施[4]。常用藥物分為促尿酸排泄藥(如丙磺舒)、抑制尿酸生成藥(如黃嘌呤氧化酶抑制劑)、堿化尿液藥(如碳酸氫鈉片)和尿酸酶合成劑(如拉布立酶)4類[5]。這4類藥物廣泛應(yīng)用于臨床，其降尿酸效果顯著，療效確切[6]，得到普遍認(rèn)可。但長期服用此類降尿酸藥易出現(xiàn)斑丘疹、脫發(fā)、胃腸道反應(yīng)及腎臟毒性等副作用[7-8]。

中醫(yī)學(xué)并無HUA病名，由于無癥狀型HUA可演變?yōu)橥达L(fēng)，故經(jīng)典文獻(xiàn)多將其歸為“痹證”“痛風(fēng)”“白虎歷節(jié)”等范疇[9]。歷代醫(yī)家認(rèn)為，HUA的發(fā)生與后天飲食不節(jié)、年老體弱、臟腑不調(diào)及先天稟賦不足有關(guān)。病機(jī)為嗜食海鮮肥甘、辛辣煎炸之品易蘊(yùn)濕生熱，又逢先天體質(zhì)虛弱，外感風(fēng)、寒、濕、熱邪氣，致脾胃運(yùn)化失司，水濕停留，郁久化熱，釀結(jié)成毒，濕熱濁毒阻塞經(jīng)脈、血絡(luò)而發(fā)病[10]。王先敏等[11]通過臨床大數(shù)據(jù)分析得出，HUA主要分為水濕內(nèi)停、濕熱、痰濁阻滯、血瘀、氣陰不足、脾氣虧虛、腎陽不足7個證型，其中以水濕停留、濕熱最為常見。中醫(yī)理論的“濕”相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)概念中的“尿酸”[12]。治療上以清熱化濕、解毒化濁為主[13]。由于HUA早期僅表現(xiàn)為尿酸值異常升高，可無任何臨床癥狀，易忽略血清尿酸等輔助檢查。如能在無癥狀HUA期間結(jié)合患者的尿酸值辨證論治，就有可能延緩甚至遏制HUA向痛風(fēng)的轉(zhuǎn)變，體現(xiàn)中醫(yī)“未病先防，既病防變”特色。杜敏等[14]臨床觀察證實(shí)，“治未病”理論管理HUA患者取得顯著療效，血尿酸等相關(guān)指標(biāo)明顯下降，疾病得到有效控制，臨床實(shí)用價值極高，極大體現(xiàn)了中醫(yī)優(yōu)勢。

青風(fēng)藤原名清風(fēng)藤，首載于宋《圖經(jīng)本草》。其味苦、辛，性平，入肝、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、疏通經(jīng)絡(luò)、通利小便之效。Zhao Z J等[15]通過小鼠模型的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤提取物青藤堿(Sinomenine)抗炎和滲透作用較其他化合物及衍生物強(qiáng)，這為青風(fēng)藤綜合治療高尿酸引發(fā)炎性反應(yīng)提供了基礎(chǔ)研究依據(jù)。此外，郝賽恒等[16]也經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，青風(fēng)藤復(fù)方顆粒(該藥的主要成分是青風(fēng)藤)具有顯著降尿酸作用。以上基礎(chǔ)研究提示，青風(fēng)藤有良好的抗炎和降尿酸作用，但其具體作用機(jī)制尚未闡明。借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測青風(fēng)藤治療HUA的作用機(jī)制具有重要的臨床意義。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從藥物與疾病間相互作用的系統(tǒng)性和整體性出發(fā)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)虛擬篩選潛在藥效成分、作用靶標(biāo)及通路，構(gòu)建“藥物-靶標(biāo)-疾病”多維網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，初步預(yù)測出藥物作用機(jī)制[17]，符合中醫(yī)的“整體觀念”和“辨證論治”特色。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測青風(fēng)藤治療HUA的作用機(jī)制，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 青風(fēng)藤的活性成分及作用靶標(biāo)的篩選和獲得 分別于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)和中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)數(shù)據(jù)庫輸入“青風(fēng)藤”，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，查找青風(fēng)藤的活性成分并查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證[18]。依次使用TCMSP、瑞士靶標(biāo)預(yù)測數(shù)據(jù)庫(Swiss Target Prediction)和中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM)收集青風(fēng)藤的作用靶標(biāo)。

1.2 HUA相關(guān)基因收集 分別于療效藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(TTD)、藥物數(shù)據(jù)庫(Drug Bank)、疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(Dis Ge NET)和人類基因數(shù)據(jù)庫(Gene cards)以“Hyperuricemia”“Gout”為關(guān)鍵詞檢索HUA相關(guān)基因。

1.3 靶標(biāo)映射 將1.1獲取的青風(fēng)藤候選作用靶標(biāo)和1.2收集的HUA相關(guān)基因分別導(dǎo)入繪圖軟件Venny 2.1中進(jìn)行靶標(biāo)映射。Venny 2.1用于展示在不同的事物集合之間的邏輯聯(lián)系，尤其適用于表示集合之間的關(guān)系。

1.4 生物學(xué)過程與通路富集分析 將靶標(biāo)映射所獲取的基因以P<0.05為篩選條件分別借助基迪奧生物信息云平臺(Omicshare)、生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫(DAVID)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。DAVID是生物信息數(shù)據(jù)庫，整合生物學(xué)數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，用于差異基因功能和通路富集分析。

1.5 成分-靶標(biāo)-通路多維生物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 將篩選出的青風(fēng)藤與HUA共同靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，構(gòu)建成分-靶標(biāo)-信號通路多維生物網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape是一款圖形化顯示網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析和編輯的軟件。

2 結(jié)果

2.1 青風(fēng)藤活性成分 TCMSP數(shù)據(jù)庫共查到青風(fēng)藤有16個活性成分，其中以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為限定條件，共得到6個活性成分，TCMID共獲得45個作用成分。將這2個數(shù)據(jù)庫匯總?cè)ブ貜?fù)值并查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證[18]，最后篩選出26個活性成分。見表1。

表1 青風(fēng)藤活性成分

2.2 青風(fēng)藤作用靶標(biāo) TCMSP收集到5HT2A、ADA1A、ADA1B等360個青風(fēng)藤作用靶標(biāo)，Swiss Target Prediction收集到RORC、SREBF2、AR等390個作用靶標(biāo)，BATMAN-TCM收集到VDR、CYP27B1、GC等301個靶標(biāo)。將其匯總?cè)ブ貜?fù)值共得到499個靶標(biāo)。

2.3 HUA相關(guān)基因的獲得 TTD得到XDH和URAT1共2個基因，Drug Bank得到ALB、FABPI、AOX等共29個基因，Dis Ge NET得到XDH、ABCG2、SLC2A9等共196個基因，Gene cards得到UMOD、SARS2、HPRT1等共625個基因，最后歸納匯總刪除重復(fù)值后共得到744個HUA相關(guān)基因。

2.4 青風(fēng)藤與HUA共同靶標(biāo)映射分析 將篩選出青風(fēng)藤和HUA靶標(biāo)進(jìn)行映射共得到基因CYP27B1、MED1、BAX等58個基因。見圖1。

圖1 青風(fēng)藤與HUA共同靶標(biāo)映射圖

2.5 青風(fēng)藤與HUA共同靶標(biāo)的生物學(xué)過程與通路富集分析 借助DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析包括生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function，MF)3個部分，BP有positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promote、response to drug、negative regulation of cell proliferation等79個條目，CC有cytoplasm、plasma membrane、mitochondrion等26個條目，MF有protein homodimerization activity，identical protein binding，heme binding等22個相關(guān)的條目。其中涉及的BP包括腺苷酸環(huán)化酶激活多巴胺受體信號通路、調(diào)控炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞增殖等，CC包括細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、線粒體等，MF包括黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合、花生四烯酸環(huán)氧酶活性、Ras鳥苷核苷酸交換因子活性等。以“Count”從大到小依次排列，取文獻(xiàn)和臨床報(bào)道較多的生物學(xué)過程進(jìn)行可視化處理(見圖2)。KEGG通路分析對涉及的58個青風(fēng)藤與HUA共同靶標(biāo)的信號通路中的作用進(jìn)行了篩選，得到了PI3K-Akt signaling pathway、Serotonergic synapse、Dopaminergic synapse等38條信號通路。以“Count”從大到小依次排列，取前10條通路進(jìn)行可視化處理(見圖3)。

圖2 GO富集分析圖

圖3 KEGG通路分析圖

2.6 成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果與分析 利用Cytoscape 3.2.1軟件，建立“青風(fēng)藤—成分—基因—通路”圖(見圖4)，圖中清晰地表現(xiàn)了58個青風(fēng)藤與HUA共同靶標(biāo)分布于不同的通路，體現(xiàn)了青風(fēng)藤對HUA的治療機(jī)制。圖中共有84個節(jié)點(diǎn)，131條邊。面積的大小是根據(jù)成分、靶標(biāo)和通路節(jié)點(diǎn)和邊數(shù)目依次分布，圖中面積越大青風(fēng)藤與HUA的成分靶標(biāo)以及通路連線節(jié)點(diǎn)數(shù)目越密集，同時為保證青風(fēng)藤治療HUA的作用靶標(biāo)及機(jī)制預(yù)測的相對客觀、全面，結(jié)合查閱相關(guān)實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)，初步預(yù)測出青風(fēng)藤的作用成分可能是Sinomenine(青藤堿)，有效靶標(biāo)可能是次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT1)和前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)，作用通路可能是PI3K- Akt signaling pathwa(磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶通路)和cAMP signaling pathway(環(huán)磷酸腺苷通路)。

圖4 成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，HUA不僅可以進(jìn)展為痛風(fēng)，而且還可引發(fā)糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、原發(fā)性高血壓等疾病，已成為我國第二大代謝性疾病，嚴(yán)重威脅人們健康[19]。青風(fēng)藤治療HUA療效確切[16]，但具體機(jī)制尚不明確。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，獲取其治療HUA主要成分及相關(guān)的疾病基因，然后進(jìn)行GO和KEGG富集分析預(yù)測青風(fēng)藤治療HUA的作用機(jī)制。

本研究通過Cytoscape 3.2.1軟件共篩選出Sinomenine、beta-sitosterol、syringaresinol、Michelenolide等13個青風(fēng)藤主要成分。Cabau G等[20]臨床研究證實(shí)，HUA與多種常見的成人炎性疾病有關(guān)。Wang Lan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤主要成分Sinomenine、magnoflorine、menisperine和stepharanine是主要抗炎化合物，其中Sinomenine報(bào)道最多。Xu W等[22]研究證明，Sinomenine對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生均有抑制作用。Zhu Q等[23]經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不同劑量的Sinomenine均具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗過敏作用。Qian L等[24]也發(fā)現(xiàn)，Sinomenine可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性治療炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病。因此，Sinomenine可通過抑制炎性反應(yīng)而發(fā)揮治療成年人HUA的作用。

通過青風(fēng)藤與HUA共同靶標(biāo)進(jìn)行映射得到基因CYP27B1、MED1、BAX、HPRT1和PTGS2等共58個基因，其中HPRT1和PTGS2參與了HUA的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HUA由尿酸產(chǎn)量增加或排泄減少所致[4]，Li L等[25]研究發(fā)現(xiàn)，HPRT可以改善內(nèi)源性嘌呤的產(chǎn)生，進(jìn)而減少尿酸的過量產(chǎn)生和積累。此外，HUA最常見的并發(fā)癥是痛風(fēng)。Mishima E等[26]臨床研究發(fā)現(xiàn)，即使沒有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，HPRT缺乏也是家族性青少年痛風(fēng)的潛在原因。Cheng M H等[27]研究表明治療痛風(fēng)的代表性藥物丙磺舒可通過抑制PTGS2(也稱COX-2)和PI3K- Akt途徑抑制活性氧(ROS)的產(chǎn)生并發(fā)揮抗破骨細(xì)胞活性。從上分析可得出HPRT基因部分缺乏可導(dǎo)致尿酸生成過量，PTGS2基因則主要參與了抑制痛風(fēng)的重要環(huán)節(jié)。

GO和KEGG富集分析表明，青風(fēng)藤治療HUA的通路是PI3K- Akt signaling pathway和cAMP signaling pathway。Wang C等[28]研究也證明，硫氧還蛋白(Trx)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的激活和遷移作用與cAMP-PKA通路和PI3K-Akt通路有關(guān)。Balakumar P等[29]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K- Akt通路與腎性HUA密切相關(guān)。Chen C等[30]通過曲霉菌素(AST)干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠模型發(fā)現(xiàn)，AST可以通過下調(diào)PI3K- Akt信號通路發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而改善OA癥狀。Li K等[31]研究證明，羅替戈汀緩釋微球(RTGT-MS)對炎性疼痛模型大鼠的保護(hù)作用與降低cAMP、COX-2和前列腺素E2(PGE2)含量有關(guān)。以上研究顯示，PI3K- Akt通路和cAMP通路在降尿酸、抗炎和鎮(zhèn)痛中發(fā)揮著作用。

綜上所述，本研究初步預(yù)測青風(fēng)藤治療HUA的作用機(jī)制可能是Sinomenine通過作用于HPRT1和PTGS2關(guān)鍵靶標(biāo)調(diào)控PI3K-Akt和cAMP信號通路，進(jìn)而發(fā)揮減少尿酸生成、抑制炎性反應(yīng)和保護(hù)腎臟。在臨床和基礎(chǔ)研究中均未找到青風(fēng)藤活性成分14-methylhexadecanoicacid Michelenolide和sinalbin治療HUA的證據(jù)，此方面研究空白可為醫(yī)學(xué)工作者提供思路。下一步將對Sinomenine的HPRT1和PTGS2基因開展基礎(chǔ)和臨床研究，為明確青風(fēng)藤治療HUA的作用靶標(biāo)和機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。