孫瑞胤，王瑞雪，鄂晶晶，姚彩青，何宗柏，張巧玲，陳子超，馬蓉澤，包秋華，王俊國(guó)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

益生菌一詞源于希臘語(yǔ)，意思是“對(duì)生命有益”。2002 年世界糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）專家組對(duì)益生菌做出了定義，即通過(guò)攝取適當(dāng)?shù)牧?，?duì)使用者的身體健康能發(fā)揮有效作用的細(xì)菌[1]。研究發(fā)現(xiàn)益生菌制劑中菌株活性對(duì)最終產(chǎn)品的益生功效起到至關(guān)重要的作用[2]。菌株常通過(guò)干粉狀態(tài)進(jìn)行運(yùn)輸與貯藏，在一定時(shí)期抑制菌株生理活性，從而延長(zhǎng)其保質(zhì)期并節(jié)約運(yùn)輸成本[3]。目前工業(yè)生產(chǎn)中主要通過(guò)真空冷凍干燥法制備乳酸菌制劑，其具有活菌數(shù)高、發(fā)酵活力強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，但也會(huì)對(duì)菌體造成一定的損傷[4]。因此，保證冷凍干燥存活率至關(guān)重要。在早期的研究中，人們通常選用改變保護(hù)劑成分以及優(yōu)化凍干工藝來(lái)提高菌株的抗冷凍干燥性能，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，益生菌在冷凍干燥過(guò)程中的存活率與其生長(zhǎng)培養(yǎng)基的成分也有著十分密切的聯(lián)系[5]。

研究表明通過(guò)改變?nèi)缣荚?、氮源、生長(zhǎng)因子以及微量元素等培養(yǎng)基成分可以提高菌株的凍干存活率[5]。Rault 等[6]發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入海藻糖可以提高保加利亞乳桿菌Lb6 的冷凍存活率。包維臣等[7]將培養(yǎng)基的氮源由酵母浸膏改為動(dòng)物蛋白胨時(shí)，保加利亞乳桿菌ND02 在真空冷凍干燥過(guò)程的存活率明顯升高。Carvalho 等[8]發(fā)現(xiàn)當(dāng)甘露糖替代MRS 培養(yǎng)基中的葡萄糖時(shí)，保加利亞乳桿菌具有更好地抗冷凍干燥性能。張鈺等[1]發(fā)現(xiàn)鈣能夠刺激鼠李糖乳桿菌ZY 的生長(zhǎng)，使其細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)鏈變?yōu)槎替?。蘇郁文等[9]發(fā)現(xiàn)鈣離子的添加能夠提高鼠李糖乳桿菌GG 在噴霧干燥過(guò)程中的存活率。除此之外，一些微量元素，如鎂離子[10?11]、錳離子[12]和鐵離子[4]添加到培養(yǎng)基中時(shí)均可促進(jìn)不同菌株的生長(zhǎng)量。由此可知，改變培養(yǎng)基成分，如碳源，氮源，生長(zhǎng)因子及微量元素均可有效提高菌株的生長(zhǎng)量及冷凍干燥抗性。

雖已有研究表明在培養(yǎng)基中添加鈣離子可提高菌株冷凍干燥的抗性[13]，但對(duì)其作用機(jī)制研究尚少。本研究以植物乳桿菌LIP-1 為研究對(duì)象，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的鈣離子，探究鈣離子對(duì)該菌株培養(yǎng)后的活菌數(shù)及抗冷凍干燥性能的影響，并通過(guò)菌株大小分布、關(guān)鍵酶活以及細(xì)胞膜脂肪酸的檢測(cè)來(lái)探討其內(nèi)在作用機(jī)制，同時(shí)通過(guò)8 周常溫貯藏實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其貯藏穩(wěn)定性，以期為今后提升菌株的冷凍干燥抗性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌 LIP-1（Lactobacillus plantarumLIP-1）是一株分離自新疆自然發(fā)酵酸馬奶，擁有較好的耐酸耐膽鹽特性及較強(qiáng)的降膽固醇活性的益生菌[14]由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；氯化鈣（分析純） 天津永晟精細(xì)化工有限公司；正己烷（色譜純） 福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；30wt%甲醇鈉溶液（色譜純）、氯仿（色譜純）上海麥克林生化科技有限公司；堿性磷酸酶試劑盒、Na+K+-ATP 酶試劑盒 北京索萊寶試劑公司。

移液槍 德國(guó)Eppendorf；MLS-3750 型滅菌鍋、STAC-S45F 型恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋；Centrifuge-5810R 高速離心機(jī) 德國(guó)艾本德；ZHJH-1214B 超凈工作臺(tái) 南京依貝儀器設(shè)備有限公司；FD-1A-50 真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DW-86L388J 醫(yī)用低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；SP-650 型全自動(dòng)干熱滅菌箱 日本ASVANTEC；ND100-1 干式氮吹儀 南京肯凡電子科技有限公司；Technologies 6850 氣相色譜 上海安捷倫科技（有限）公司；DSM5000 CS 顯微鏡 德國(guó)萊卡；細(xì)胞破碎儀VCX750 美國(guó)Sonics。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制[15]凍干保護(hù)劑：蒸餾水82 mL、脫脂乳 10.0 g、蔗糖 8.0 g、L-谷氨酸鈉 0.1 g，115 ℃滅菌7 min，滅菌完成后置于冰水混合物中快速冷卻，4 ℃保存?zhèn)溆?；MRS 液體培養(yǎng)基：葡萄糖 20.0 g、大豆蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母粉 5.0 g、無(wú)水乙酸鈉 5.0 g、無(wú)水磷酸氫二鉀 2.0 g、檸檬酸鈉2.0 g、七水硫酸鎂 0.2 g、五水硫酸錳 0.05 g、吐溫?80 1 mL。加蒸餾水 1000 mL，121 ℃滅菌 15 min；MRS 固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上額外添加瓊脂12 g/L，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 菌株活化[15]將貯藏于?80 ℃冰箱中的植物乳桿菌LIP-1 融化，以2%接菌量接種于液體MRS 培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，在4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 鈣離子對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響 將MRS培養(yǎng)基中菌株以2%接菌量分別接種于外加0（對(duì)照組）、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 mmol/L 氯化鈣的液體MRS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h 后進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)(以后均簡(jiǎn)稱計(jì)數(shù)）。

1.2.4 鈣離子培養(yǎng)后菌株的干燥[15]將預(yù)凍于?80 ℃冰箱中6 h 后，添加了保護(hù)劑的菌泥，置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，凍干條件為：冷阱溫度?48 ℃，20 Pa，18 h。

1.2.4.1 鈣離子培養(yǎng)后菌株的真空冷凍干燥活菌數(shù)[15]將不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)出的菌株，凍前計(jì)數(shù)后，加入2 mL 冷凍干燥保護(hù)劑，并充分混勻，預(yù)凍6 h，后凍干，凍干后計(jì)數(shù)。

1.2.5 電鏡觀察 對(duì)（MRS）對(duì)照組與添加0.5 mmol/L鈣離子的實(shí)驗(yàn)組使用光學(xué)顯微鏡拍攝照片，該顯微鏡配有100 倍HCX PL APO 物鏡。為了更好地觀察細(xì)胞，細(xì)胞使用結(jié)晶紫染色。顯微鏡拍攝后，使用Image J 對(duì)菌株進(jìn)行長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 Na+K+-ATP 酶活力的測(cè)定[16]將冷凍干燥樣品復(fù)水離心棄上清，菌泥用 0.85% NaCl 溶液清洗2 次后，加入2 mL 酶提取液，后進(jìn)行超聲波破碎（超聲3 s，間隔10 s，7 min）；4 ℃，15000 r/min，離心10 min 取上清，用于后續(xù)相關(guān)酶活測(cè)定。Na+K+-ATP 酶試劑盒分別對(duì)組樣品進(jìn)行相關(guān)酶活的3 次重復(fù)測(cè)定，酶活的單位用U/g 表示。

1.2.7 堿性磷酸酶活檢測(cè)[16]取菌泥0.1 g，加入0.05 mL 甲苯輕搖15 min；堿性磷酸酶試劑盒分別對(duì)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)酶活測(cè)定，酶活的單位用U/g 表示。

1.2.8 細(xì)胞膜脂肪酸的提取及含量測(cè)定

1.2.8.1 細(xì)胞膜脂肪酸的提取 參考陳境[15]的提取方式。首先，用無(wú)菌去離子水對(duì)凍前實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組反復(fù)離心洗滌三次（4000 r/min，4 ℃，5 min）。棄上清液后，稱取菌泥0.5 g，向其中加入1.9 mL 氯仿-甲醇溶液（氯仿:甲醇為1:2 制備溶液,V/V），振蕩15 min。加入0.625 mL 氯仿及0.625 mL 無(wú)菌去離子水，振蕩15 min，離心10 min（4 ℃，8000 r/min）。吸取下層液相，移至無(wú)菌離心管。氮吹30 min 吹干，加入1 mL 甲醇鈉-甲醇（1 moL/L），冰浴后振蕩5 min。最后加入0.625 mL 正己烷，離心5 min（4 ℃，8000 r/min），吸取上清液后經(jīng)有機(jī)過(guò)濾器移入氣象瓶中。

1.2.8.2 細(xì)胞膜脂肪酸含量的測(cè)定 同1.2.8.1 參考陳境[15]的測(cè)定方式。氣相色譜條件：DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 μm×0.25 mm）；氮?dú)?，分流?:1，流速1 mL/min；進(jìn)樣口250 ℃；檢測(cè)口260 ℃；柱溫程序：初始溫度80 ℃，升溫速率6.5 ℃/min；170 ℃，升溫速率27.5 ℃/min；215 ℃保持2 min；升溫速率40 ℃/min，230 ℃保持2 min。進(jìn)樣量3 μL。脂肪酸含量計(jì)算采用面積歸一法。

1.2.9 菌株的貯藏穩(wěn)定性 菌株經(jīng)真空凍凍干燥后，置于25 ℃恒溫箱中避光貯藏，每隔一周取出計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

氣相數(shù)據(jù)為儀器記錄數(shù)據(jù)導(dǎo)出后經(jīng)Excel 處理得出。數(shù)據(jù)均為3 組平行實(shí)驗(yàn)得到，應(yīng)用SPSS26.0軟件進(jìn)行顯著性分析，P<0.05 為顯著性水平，并使用Origin 2018 與Excel 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鈣離子濃度對(duì)LIP-1 真空冷凍干燥存活率的影響

如圖1 所示，對(duì)照組（普通MRS 培養(yǎng)基）中，植物乳桿菌LIP-1 凍前生長(zhǎng)量為（3.30±0.54）×109CFU/mL；鈣離子濃度低于1 mmol/L 時(shí)，其冷凍干燥存活率逐步提升。但當(dāng)鈣離子濃度為0.75 mmol/L時(shí)，菌株冷凍干燥前，培養(yǎng)基已經(jīng)對(duì)菌株的生長(zhǎng)出現(xiàn)了抑制作用，造成了冷凍干燥前菌株生長(zhǎng)量降低，即使存活率高于其他組，但實(shí)際活菌數(shù)僅為（3.50±0.33）×109CFU/mL。鈣離子濃度為0.5 mmol/L 時(shí)，凍前菌株生長(zhǎng)量達(dá)到了（4.02±0.38）×109CFU/mL，凍干后菌株存活數(shù)相較對(duì)照組增長(zhǎng)了69.63%，為（3.08±0.27）×109CFU/mL，其冷干前后活菌數(shù)均高于其他組，且冷凍干燥存活率（76.67%±5.00%）相較未添加鈣離子的對(duì)照組（55.15%±1.50%）顯著提高（P<0.05），菌株擁有較高的冷凍干燥抗性，因此選擇鈣離子濃度為0.5 mmoL/L 進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 不同Ca2+濃度（mmol/L）對(duì)LIP-1 真空冷凍干燥存活率的影響Fig.1 The effect of different concentrations of Ca2+ on the survival rate of LIP-1 vacuum freeze-drying

2.2 鈣離子對(duì)植物乳桿菌LIP-1 細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2 所示為植物乳桿菌LIP-1 在不同培養(yǎng)條件下的顯微電鏡下的長(zhǎng)度分布圖。由圖2 可知，對(duì)照組（普通MRS 培養(yǎng)基）培養(yǎng)下植物乳桿菌LIP-1 的長(zhǎng)度范圍集中在1.1 ～1.7 μm 之間，而添加了0.5 mmoL/L 鈣離子培養(yǎng)出的植物乳桿菌LIP-1 則集中分布于0.8～1.4 μm 之間。經(jīng)含有鈣離子的MRS培養(yǎng)基（對(duì)照組）培養(yǎng)出的植物乳桿菌LIP-1 平均長(zhǎng)度相較于普通MRS（實(shí)驗(yàn)組）培養(yǎng)基培養(yǎng)出的植物乳桿菌LIP-1 長(zhǎng)度縮短了約0.4 μm，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張鈺[1]研究相同。相關(guān)文獻(xiàn)表明，短桿相較于長(zhǎng)桿更具穩(wěn)定性[10]，因此當(dāng)植物乳桿菌LIP-1 加入0.5 mmoL/L的鈣離子后具有較高的冷凍干燥抗性。

圖2 對(duì)照組（MRS）與實(shí)驗(yàn)組（添加0.5 mmoL/L 鈣離子的MRS）的長(zhǎng)度分布圖Fig.2 Experimental group (MRS with 0.5 mmoL/L calcium ion) and control group (MRS) length distribution diagram

2.3 細(xì)胞壁損傷評(píng)價(jià)

如圖3 所示為植物乳桿菌LIP-1 在不同培養(yǎng)條件下，經(jīng)真空冷凍干燥前后菌株的堿性磷酸酶變化。堿性磷酸酶（AKP）存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，正常情況下細(xì)菌培養(yǎng)液中只能檢測(cè)到少量的AKP，只有當(dāng)細(xì)胞壁通透性增大或損壞時(shí)，指示液中AKP 含量才會(huì)增加，所以可以通過(guò)檢測(cè)AKP 活性來(lái)反映細(xì)胞壁損傷的情況[16]。由圖3 可知，冷凍干燥處理前對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組AKP 的酶活無(wú)顯著差異（P>0.05）。經(jīng)冷凍干燥處理后，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組AKP 的含量均顯著增加（P<0.05），說(shuō)明菌體經(jīng)凍干處理后，菌體的細(xì)胞壁受到損傷，且對(duì)照組AKP 的含量（595.45±3.55）U/g 顯著高于實(shí)驗(yàn)組（543.75±2.50）U/g（P<0.05）。結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)奶砑逾}離子可提高菌體細(xì)胞壁的穩(wěn)定性。

圖3 真空冷凍干燥前后LIP-1 的堿性磷酸酶變化Fig.3 Changes of alkaline phosphatase of LIP-1 before and after vacuum freeze-drying

2.4 細(xì)胞膜損傷評(píng)價(jià)

如圖4 所示為植物乳桿菌LIP-1 在不同培養(yǎng)條件下，經(jīng)真空冷凍干燥前后菌株的Na+K+-ATP 酶活性變化。Na+K+-ATP 酶是一種生物膜酶，存在細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中，通過(guò)催化ATP 水解提供能量，驅(qū)動(dòng)Na+向細(xì)胞外和K+向膜內(nèi)進(jìn)行運(yùn)輸，維持細(xì)胞膜兩側(cè)的膜電位及乳酸菌菌體細(xì)胞的正常生理功能。所以Na+K+-ATP 酶可以在一定程度上反映細(xì)胞膜的通透性[16]。在真空冷凍干燥前實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組酶活性無(wú)顯著差異，分別為（19.32±0.12） U/g 與（19.41±0.22）U/g。經(jīng)冷凍干燥后對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)了顯著差異（P<0.05），對(duì)照組酶活為（10.65±0.15）U/g，實(shí)驗(yàn)組是（16.85±0.26）U/g，這說(shuō)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)出的菌株相較于對(duì)照組（普通MRS 組）有效的提升了菌株的抗冷凍干燥性。

圖4 真空冷凍干燥前后菌株的Na+K+-ATP 酶活性變Fig.4 Changes of Na+K+-ATPase activity of strains before and after vacuum freeze-drying

2.5 鈣離子對(duì)植物乳桿菌LIP-1 細(xì)胞膜脂肪酸的影響

細(xì)胞膜脂肪酸組成成分是影響菌株抗冷凍干燥性能的重要指標(biāo)。在冷凍干燥過(guò)程中，乳酸菌可以通過(guò)脂肪酸脫氫酶調(diào)節(jié)飽和/不飽和脂肪酸的比例。飽和/不飽和脂肪酸的比例決定了細(xì)胞膜的流動(dòng)性和完整性，不飽和脂肪酸相對(duì)含量高的菌株具有較好的細(xì)胞膜流動(dòng)性和完整性，從而提高菌體對(duì)凍干的抵抗能力[5,13]。通過(guò)對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸的測(cè)定發(fā)現(xiàn)（如圖5所示），細(xì)胞膜中主要包含8 種細(xì)胞膜脂肪酸，分別為月桂酸（C12:0）、肉蔻豆酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）、棕 櫚 油 酸（ C16:1） 、 硬 脂 酸（ C18:0） 、 油 酸（C18:1w9c）、亞油酸（C18:2）及環(huán)丙烷脂肪酸（19cyc9，10）；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組脂肪酸的相對(duì)含量存在顯著性差異，其中，棕櫚酸（C16:0）和肉蔻豆酸（C14:0）兩種飽和脂肪酸占總脂肪酸比例顯著降低（P<0.05），而油酸（C18:1w9c）、環(huán)丙烷脂肪酸（19cyc）以及亞油酸（C18:2）占比卻顯著提升（P<0.05）。并且實(shí)驗(yàn)組中不飽和度（U/S）為0.6312 明顯高于對(duì)照組（0.5587）。因此，在培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)奶砑覥a2+可使細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸含量增加，不飽和度（U/S）的比值升高，提高了細(xì)胞膜的流動(dòng)性和完整性，從而明顯提高了菌體的冷凍干燥抗性。

圖5 普通MRS（對(duì)照組）與添加0.5 mmoL/L Ca2+（實(shí)驗(yàn)組）的細(xì)胞膜脂肪酸組成Fig.5 Proportion of main fatty acids of LIP-1 cultured by ordinary MRS (control group) and 0.5 mmoL/L Ca2+(experimental group)

有研究報(bào)道，細(xì)胞中蛋白酶、脂肪酶、ATP 酶等多種酶，均與鈣離子的作用相關(guān)[17]。Heibrunn 等[18]報(bào)道，Ca2+具有影響酶活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的透性、控制代謝等功能[19]。由此我們推測(cè)Ca2+可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸脫氫酶的活性從而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜飽和/不飽和脂肪酸的比例，進(jìn)而提高了菌株的冷凍干燥抗性。

2.6 不同濃度鈣離子對(duì)菌株冷凍干燥后常溫貯藏穩(wěn)定性的影響

如圖6、圖7 所示，本研究通過(guò)檢測(cè)真空冷凍干燥后植物乳桿菌LIP-1 在25 ℃環(huán)境下貯藏8 周的活菌數(shù)反映其貯藏穩(wěn)定性，同時(shí)通過(guò)存活率變化評(píng)價(jià)其下降幅度。由圖6 可知，菌株在貯藏2～8 周時(shí)，在培養(yǎng)基中添加了鈣離子可顯著提升菌株活菌數(shù)且存活率降幅較小，從而提高了菌株的貯藏穩(wěn)定性（P<0.05）。隨著鈣離子濃度的增加，菌株貯藏穩(wěn)定性提高。由于當(dāng)鈣離子濃度過(guò)高時(shí)菌株生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，影響了貯藏初始菌株密度，從而造成了第8 周時(shí)2 mmoL/L 鈣離子雖然擁有較高的存活率，但是實(shí)際活菌數(shù)僅為（8.7±0.11）×108CFU/mL，低于添加鈣離子培養(yǎng)基的其他組。這表明，鈣離子的加入可以有效地提高植物乳桿菌LIP-1 的貯藏穩(wěn)定性，并且隨著鈣離子濃度升高，貯藏穩(wěn)定性隨之升高[20]。鈣離子對(duì)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的保護(hù)作用[13]可提高菌株的冷凍干燥抗性及貯藏穩(wěn)定性。普通MRS 培養(yǎng)基中，初始菌濃度為（2.31±0.18）×109CFU/mL，當(dāng)貯藏8 周后，活菌數(shù)為（1.9±0.14）×108CFU/mL，存活率僅為8.06%。綜上所述，當(dāng)鈣離子濃度為0.5 mmoL/L 時(shí)，菌株生長(zhǎng)情況良好，8 周內(nèi)貯藏穩(wěn)定性較高，經(jīng)8 周貯藏后的活菌數(shù)仍有（1.09±0.11）×109CFU/mL。

圖6 LIP-1 經(jīng)不同濃度Ca2+培養(yǎng)后的常溫貯藏活菌數(shù)Fig.6 The number of viable bacteria stored at room temperature after LIP-1 was cultured with different concentrations of Ca2+

圖7 LIP-1 經(jīng)不同濃度Ca2+培養(yǎng)后的常溫貯藏存活率Fig.7 The survival rate of LIP-1 after being cultured with different concentrations of Ca2+

3 討論

不同培養(yǎng)基成分會(huì)造成菌株形態(tài)和生理上的改變，進(jìn)而導(dǎo)致了其對(duì)外界不良環(huán)境的抗性不同。首先從形態(tài)上，在培養(yǎng)基中添加例如豬源蛋白胨[21]和鈣離子[22?23]等會(huì)縮短菌株形態(tài)，此時(shí)菌體表面積減小，在冷凍過(guò)程中形成的冰晶對(duì)其細(xì)胞膜的機(jī)械損傷減少，從而菌體的冷凍干燥抗性提高。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.5 mmoL/L 的鈣離子時(shí)，菌株形態(tài)由長(zhǎng)桿轉(zhuǎn)變?yōu)槎虠U，且菌株的生長(zhǎng)量由（3.3±0.54）×109CFU/mL 增加到（4.02±0.38）×109CFU/mL，凍干存活率提高了21.52%，這一結(jié)果再次驗(yàn)證在凍干過(guò)程中，鈣離子可以通過(guò)改變菌株形態(tài)減少其在冷凍過(guò)程中所受到的損傷。

對(duì)于細(xì)菌而言，細(xì)胞壁與細(xì)胞膜至關(guān)重要。其中，細(xì)胞壁是位于細(xì)胞膜外的一層較厚、較堅(jiān)韌并略具彈性的結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌既能適應(yīng)多變的環(huán)境，又能維持細(xì)菌的結(jié)構(gòu)[11]。本研究通過(guò)對(duì)AKP 酶的泄漏量的測(cè)定來(lái)評(píng)估細(xì)胞壁的損傷程度，發(fā)現(xiàn)鈣離子的加入有效保護(hù)了植物乳桿菌LIP-1 的細(xì)胞壁完整性，降低了其在冷凍干燥中受到的損傷，這是由于鈣離子可通過(guò)電荷作用來(lái)維持細(xì)胞壁的完整性[24]。

細(xì)胞膜可以使菌體與外部環(huán)境隔離，是保護(hù)乳酸菌的主要屏障。在冷凍干燥過(guò)程中，細(xì)胞膜受損也是導(dǎo)致細(xì)菌死亡的主要原因之一[25]。Na+K+-ATP 酶可以使橫跨膜產(chǎn)生電勢(shì)，從而起到維持細(xì)胞內(nèi)外pH 動(dòng)態(tài)平衡的作用。冷凍干燥過(guò)程會(huì)使得Na+K+-ATP 酶活性降低甚至失活[26]，從而細(xì)胞膜完整性受損，細(xì)菌的凍干存活率降低。因此可以通過(guò)測(cè)定Na+K+-ATP 酶活性來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞膜的損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)鈣離子的加入有效保護(hù)了植物乳桿菌LIP-1 的細(xì)胞膜，降低了其在冷凍干燥中受到的損傷。這與細(xì)胞膜脂肪酸成分的改變有密切聯(lián)系。菌株在冷凍干燥后，其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，其中的不飽和脂肪酸相對(duì)含量是評(píng)估冷凍干燥過(guò)程細(xì)胞膜流動(dòng)性與完整性的重要指標(biāo)[27]。Li 等[28]發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸含量高的菌株，在冷凍干燥過(guò)程中會(huì)有更大的存活率。并且，適當(dāng)改變培養(yǎng)基成分可使細(xì)胞膜上飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變速率加快，從而有助于保持膜在凍干過(guò)程中的流動(dòng)性[29]。但目前關(guān)于添加鈣離子對(duì)經(jīng)凍干處理后菌株細(xì)胞膜的變化尚未報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)Na+K+-ATP 酶活性以及脂肪酸含量變化的檢測(cè)，評(píng)價(jià)了鈣離子對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作用。結(jié)果表明，鈣離子的加入提高了Na+K+-ATP 酶的活性，進(jìn)而更好地維持了細(xì)胞膜的通透性，降低了細(xì)胞膜的損傷程度；同時(shí)，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量升高，U/S 變大，細(xì)胞膜流動(dòng)性增強(qiáng)，提高了菌株的冷凍干燥存活率。綜上所述，在培養(yǎng)基中添加鈣離子可有效保護(hù)菌株的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，提高了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而使菌株具有較強(qiáng)的冷凍干燥抗性及貯藏穩(wěn)定性。但本研究并未結(jié)合基因組學(xué)，蛋白組學(xué)，代謝組學(xué)等對(duì)細(xì)胞的變化進(jìn)行深入探討，只是基于表觀特征初步的探討了鈣離子對(duì)菌株的影響，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的鈣離子（0.5 mmoL/L），可以促進(jìn)植物乳桿菌LIP-1 的生長(zhǎng)量，相較于未添加鈣離子的培養(yǎng)基活菌數(shù)增長(zhǎng)了0.717×109CFU/mL，并且顯著提高其冷凍干燥存活率。經(jīng)電鏡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加鈣離子使菌株形態(tài)由長(zhǎng)桿向短桿轉(zhuǎn)變，平均長(zhǎng)度縮短0.4 μm；通過(guò)關(guān)鍵酶活的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組有效的保護(hù)了菌株的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜；通過(guò)對(duì)其脂肪酸成分的測(cè)定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量升高，U/S 變大（實(shí)驗(yàn)組(0.6312)明顯高于對(duì)照組(0.5587)），致使細(xì)胞膜流動(dòng)性增強(qiáng)，進(jìn)而顯著的增加了植物乳桿菌LIP-1 的冷凍干燥存活率。